用于提高苯尼达唑活性的壳聚糖纳米凝胶

本研究利用废弃蟹壳提取的壳聚糖与三聚磷酸盐、柠檬酸通过离子交联制备纳米凝胶（CS-Bzn-NGs），显著提高苯佐卡因的生物利用度和缓释特性。体外释放实验显示5小时内释放70%药物，完全释放需更换缓冲液。纳米凝胶在HeLa细胞和美洲锥虫裂殖子中无毒性，且对三种DTU不同虫期的美洲锥虫均表现出与游离苯佐卡因相当的杀虫活性，尤其在低浓度时效果更优。该可持续纳米递药系统为慢性期美洲锥虫病治疗提供新方案。

　　

作者名单：Daniel Musikant、Luna Magrotti-Messa、Matías Schafrik、Luciana P. Pelazzo、Ezequiel Rossi、María I. Errea、Oscar E. Perez、Martín Edreira、Adriana A. Kolender

研究机构：阿根廷布宜诺斯艾利斯大学CONICET生物化学研究所（隶属于精确与自然科学学院），地址：Intendente Güiraldes 2160，C1428EHA，布宜诺斯艾利斯

摘要

查加斯病由克鲁兹锥虫（Trypanosoma cruzi）引起，仍是一种被忽视的重大疾病，治疗选择有限。尽管苯尼达唑（Bzn）的水溶性较低、生物利用度差且副作用显著（尤其是在感染慢性期），但它仍是首选治疗方法。本文利用三聚磷酸盐（TPP）和柠檬酸通过离子凝胶化方法制备了壳聚糖（CS）纳米凝胶（NGs），作为Bzn的纳米载体，以提升其抗寄生虫效果。从可再生甲壳类动物壳废弃物中提取的壳聚糖经过纯化处理后，用于制备这些纳米凝胶，并用于包裹Bzn。所得CS-Bzn-NGs呈球形，带正电荷，稳定性至少可维持四周，水动力直径约为250纳米，药物包封效率达到77%。体外释放实验显示，Bzn在5小时内释放了70%的剂量，更换缓冲液后药物完全释放。用FITC标记的壳聚糖合成的纳米凝胶能够被HeLa细胞和克鲁兹锥虫的鞭毛体有效吸收，且不会引起细胞毒性。实验还评估了CS-Bzn-NGs对三种不同基因型克鲁兹锥虫（Sylvio、RA和Y）的杀锥虫活性，结果显示其效果与游离Bzn相当，且在较低药物浓度下仍能保持良好疗效。因此，CS-TPP-柠檬酸纳米凝胶为Bzn的递送提供了一种有前景且可持续的纳米医学平台，有助于改善查加斯病的化疗效果。

引言

查加斯病是一种由克鲁兹锥虫引起的慢性寄生虫感染，是拉丁美洲最重要的被忽视疾病之一，具有全球性影响。据估计，有1000万人感染该病，分布在21个流行国家，另有8000万人面临感染风险，造成的全球经济负担达71.9亿美元[1]。克鲁兹锥虫具有复杂的生命周期，涉及吸血昆虫（三带喙库蚊属）和哺乳动物宿主。根据寄生虫在昆虫肠道（表鞭毛体）、哺乳动物细胞外环境（鞭毛体）或感染建立后的细胞内形式（无鞭毛体）的不同阶段，其形态也会发生变化。此外，克鲁兹锥虫存在基因型异质性，被划分为六个不同的基因型单位（TcI–TcVI），以及最近在某些蝙蝠物种中发现的第七个基因型单位TcBat[2]。除了地理分布和感染特征外，不同基因型单位的寄生虫对药物的敏感性也存在差异。因此，建议在新配方测试中应涵盖至少两个不同基因型的关键寄生虫形式[3]。 苯尼达唑（Bzn）和尼福替莫克斯（Nfx）是目前治疗查加斯病的主要药物，但它们存在多种副作用，如皮疹、湿疹、瘙痒、厌食、呕吐以及头痛、眩晕、失眠和抽搐等神经系统症状[4]。这些药物的杀锥虫效果体现在能降低患者急性期的寄生虫血症[1]。然而，系统临床研究表明，Bzn在查加斯病慢性期或由寄生虫引起的心脏疾病中的疗效较差[5]。Bzn和Nfx几乎不溶于水，渗透性低，导致生物利用度有限且效果不稳定，尤其是在疾病慢性期[6]。因此，迫切需要开发新的更有效的药物，或改进现有疗法的药理特性。在这方面，多种纳米颗粒被研究作为潜在的递送系统和疗效增强剂。最近的研究指出，苯尼达唑纳米疗法的效果取决于纳米载体的形态[7]。非离子表面活性剂Poloxamer-188制成的聚合物纳米颗粒在体外和体内实验中显示出优于游离药物的效果[8]。此外，多糖纳米凝胶因其物理化学和生物学特性而被认为是有前景的药物递送系统[9][10][11]。Nahavene等人开发了用壳聚糖功能化的介孔二氧化硅纳米颗粒作为Bzn载体，在低浓度下即可抑制CL Brener株（TcVI）表鞭毛体的生长[12]。纳米凝胶（NGs）作为下一代药物递送系统受到关注，因其具有亲水性、高载药量、对外部刺激的响应性、模拟细胞外环境的特性以及纳米级结构[13]。 壳聚糖（CS）是通过脱乙酰化壳聚糖获得的多糖，主要由β-D-葡萄糖胺（GlcNH₂）单元组成，同时含有少量N-乙酰-D-葡萄糖胺（GlcNAc）单元[1]。这种多糖具有多种生物活性，如抗真菌和抗菌作用、促进植物防御反应、降低胆固醇、促进伤口愈合、抑制细菌生长以及抗氧化作用[14]。 壳聚糖纳米颗粒和纳米凝胶已被广泛应用于癌症诊断、药物递送、抗菌和抗寄生虫治疗、组织工程以及生物活性化合物的封装[15][16][17][18][19][20][21]。鉴于壳聚糖的抗菌特性及其作为纳米载体的潜力，da Silva等人制备了壳聚糖寡糖混合物（COS），成功抑制了克鲁兹锥虫表鞭毛体和利什曼原虫前鞭毛体的生长[22]。 壳聚糖水凝胶通常通过共价交联或静电离子凝胶化方法制备[15][21][23][24]，所用阴离子物质包括阴离子聚合物[25]（如海藻酸钠和三聚磷酸钠TPP[26]）或羧酸（如柠檬酸[27][28]。 在本研究中，我们利用TPP和柠檬酸通过离子凝胶化方法制备了壳聚糖纳米凝胶，同时考虑了壳聚糖和柠檬酸的生物特性，并将其用于Bzn的封装，以增强其抗寄生虫效果。据我们所知，文献中尚未报道过将壳聚糖-柠檬酸-TPP三元体系用于递送药物活性化合物的案例。此外，本研究中使用的壳聚糖来自可再生甲壳类动物外壳废弃物[29]，是一种可持续的原料来源。

实验方法片段

Bzn的提取与纯化

Abarax? 50片（每片含50毫克Bzn，共20片，总质量5.982克）被研磨后，用96%乙醇（40毫升）提取并在40°C下搅拌30分钟。过滤掉不溶性辅料，然后加入冷蒸馏水（40毫升）从上清液中回收Bzn，再过滤并干燥固体。重复此过程后获得0.329克Bzn；熔点：185°C；¹H NMR（500 MHz，DMSO-d₆，δ）：8.82

纳米凝胶的设计与表征

本研究中使用的壳聚糖来源于可再生甲壳类动物外壳（分子量300 kDa）。纯化过程包括在过量酸中 protonate 氨基团、去除不溶性颗粒、用NaOH调节pH值使中性多糖絮凝，随后用水洗涤并干燥[36]。虽然其他酸（如HCl、乳酸、柠檬酸或丙酮酸）也可用于纯化，但醋酸在效果上更为理想

讨论

Bzn是目前治疗克鲁兹锥虫最有效的药物，但其低溶解度和吸收率要求增加剂量才能达到治疗效果，但这会导致更高的毒性和不良反应[47][48]。由于其生物相容性和无毒性，壳聚糖被广泛应用于生物医学和制药领域作为药物载体。此外，壳聚糖本身具有抗菌、抗寄生虫和抗氧化作用

结论

实验结果表明，Bzn成功封装在由壳聚糖、TPP和柠檬酸组成的纳米凝胶中。Bzn从CS-Bzn-NG系统中释放（5小时内释放约70%，完全更换外部溶液后释放100%）。加入荧光标记物后，可以追踪纳米凝胶在生物相中的分布情况，并确认其能够到达目标部位。药物被限制在亲水环境中，从而提高生物利用度，同时保持其疗效

作者贡献声明

Daniel Musikant：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、实验设计、数据分析。 Luna Magrotti-Messa：初稿撰写、实验设计、数据分析。 Matías Schafrik：初稿撰写、实验设计、数据分析。 Luciana P. Pelazzo：初稿撰写、实验设计、数据分析。 Ezequiel Rossi：实验设计、数据分析。 María I. Errea：实验设计、数据分析。 Oscar E. Perez：方法学设计、数据分析。 Martín：（未明确具体贡献）

资金来源

本研究得到了布宜诺斯艾利斯大学（UBACyT 20020220300089BA、20020220400183BA）和CONICET（PIP 1120210100680CO）的资助。 DM、ER、MIR、OEP、ME和AAK均为CONICET的研究人员，LPP为CONICET的博士后研究员。

利益冲突声明

作者声明没有可能影响本研究结果的财务利益或个人关系。