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HBV抑制机制研究中发现Smc5/6复合体及其亚复合体NSMCE1/3通过20S蛋白酶体途径降解HBx蛋白，且该过程不依赖泛素化。实验证实NSMCE1/3在mRNA和蛋白水平抑制HBx表达，并影响HBV增殖。
何莉莉|沈环宇|赵翱婷|潘雨萱|马俊|欧阳竹青
华中科技大学同济医学院基础医学学院病原生物学系，中国湖北省武汉市香港路13号，430030
摘要
Smc5/6是一种具有环状结构的蛋白质复合体，能够抑制HBV的转录和增殖。HBV通过编码调节蛋白HBx来对抗这一限制，HBx能够将Smc5/6靶向蛋白酶体进行降解。然而，Smc5/6抑制HBV的分子机制仍不清楚。在本研究中，我们利用无细胞表达系统中的萤光素酶报告基因，并使用纯化的Smc5/6全复合体、亚复合体或单个亚基来测量转录活性。除了Smc5/6全复合体外，NSMCE1/3亚复合体也足以在体外抑制转录。RT-PCR和环己亚胺实验分别表明，NSMCE1/3在mRNA水平和蛋白质水平上都能抑制HBx的表达。NSMCE1/3的过表达会导致HBx的降解，而这种效应可以通过蛋白酶体抑制剂来阻断，但不能通过泛素激活酶E1的抑制剂来阻断。NSMCE1/3与20S蛋白酶体相互作用，但不会刺激HBx的泛素化，这表明NSMCE1/3通过一种不依赖于泛素的蛋白酶体机制来诱导HBx的降解。NSMCE1/3的过表达可抑制肝癌细胞系中的HBV增殖，而NSMCE3的敲低则会促进增殖。这些新发现为Smc5/6抑制HBV的分子机制提供了见解。
引言
乙型肝炎病毒（HBV）是一种全球性的健康威胁，慢性乙型肝炎感染是肝硬化和肝细胞癌的主要原因。HBV含有一个3.2 kb的基因组，其中包含部分双链DNA（称为松弛环状DNA，rcDNA），该DNA经过修复后会形成共价闭合的环状DNA（cccDNA）。随后，cccDNA被包装成微染色体，并作为病毒转录的模板。目前批准用于治疗慢性乙型肝炎的药物，包括核苷/核苷酸类似物（NAs）和干扰素α，对cccDNA无效，导致停药后HBV复制迅速复发[1]，[2]。因此，迫切需要开发新的治疗剂来沉默或消除cccDNA，从而实现慢性乙型肝炎感染的功能性治愈[3]。
HBV基因组包含四个部分重叠的开放阅读框（ORFs），分别编码HBsAg、聚合酶、HBcAg和HBx[4]。其中，HBx是最小的蛋白质，仅有154个氨基酸，但具有高度保守性。HBx在HBV复制中起着关键作用，包括激活转录、信号传导、细胞凋亡、细胞周期调控和蛋白质降解[5]。HBx通过刺激DNA转录来促进HBV的增殖和病毒蛋白的表达。事实上，HBx能够选择性地从染色体外DNA而不是染色体整合的构建体中激活基因表达[6]，并且这种转激活活性与DNA序列无关。HBx与宿主细胞中的许多蛋白质相互作用，其中与DNA损伤结合蛋白1（DDB1）的相互作用特别值得关注，因为它能促进HBV感染[7]。多项研究表明，染色体5/6复合体（Smc5/6）的结构维持是HBV的一个限制因素。它选择性地结合并阻断染色体外DNA的转录。HBx利用DDB1 E3泛素连接酶来解除这种抑制，从而将Smc5/6靶向蛋白酶体进行泛素介导的降解[8]，[9]，[10]，[11]。
Smc5/6复合体属于SMC家族，该家族还包括研究较为深入的凝聚素（Smc1/3）和凝聚素（Smc2/4）复合体[12]。Smc蛋白复合体在DNA复制、DNA修复、转录、姐妹染色单体凝聚和染色体浓缩过程中发挥作用[13]，[14]。人类Smc5/6全复合体由六个亚基组成：两个Smc蛋白（Smc5-6）和四个非结构维持染色体元件1同源物（NSMCE1-4）。与其他Smc蛋白类似，Smc5（和Smc6）的N端会折叠并与其C端一起形成一个ATP结合盒（ABC）家族ATP酶结构域。Smc5和Smc6的中间区域介导它们之间的相互作用，并形成铰链结构域。ABC ATP酶结构域和铰链结构域通过螺旋-线圈区域相连。NSMCE2是一种小型的泛素相关修饰E3连接酶[15]，它与Smc5的螺旋-线圈区域结合。NSMCE4A连接Smc5和Smc6。NSMCE1/3形成一个亚复合体，并与NSMCE4结合[16]。NSMCE1/3/4亚复合体的所有三个亚基都参与DNA结合[17]，[18]。NSMCE1是一种泛素E3连接酶，其连接活性显著受到NSMCE3的增强[19]。NSMCE1的底物包括NSMCE4、RNA聚合酶I、Mms19和Paf1转录延长复合体的组分Cdc73[20]。酵母中的NSMCE4同源物Nse4是首次被鉴定出的NSMCE1的底物。Nse4的修饰破坏会导致其他SMC5/6突变体的DNA损伤敏感性降低[21]。NSMCE1促进RNA聚合酶I亚基Rpa190的泛素化，从而促进rDNA阵列的分离[20]。此外，与MAGE F1复合的NSMCE1（而不是NSMCE3）可以促进Mms19的泛素化和降解，这一过程不依赖于Smc5/6复合体[22]。这些NSMCE1的底物突显了其在蛋白质降解和转录中的作用，以及其功能与Smc5/6复合体的不同。
在发现Smc5/6作为HBV限制因子后不久，人们发现Smc5/6还可以抑制许多其他病毒的增殖。Smc5/6与未整合的HIV DNA结合并对其进行SUMO化，导致HIV潜伏感染，这种限制活性可以被Vpr辅助蛋白拮抗[23]，[24]。Smc5/6能够感知爱泼斯坦-巴尔病毒（Epstein-Barr virus）的病毒基因组R-loop，并阻止裂解复制区的形成。病毒蛋白BNRF1通过泛素蛋白酶体途径将Smc5/6靶向降解[25]。Kaposi肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）的基因转录可以被Smc5/6复合体抑制，从而导致KSHV染色质上H3K27ac的丢失，使病毒染色质浓缩并形成抑制性染色质结构。病毒蛋白RTA通过降解Smc5/6来解除这种抑制[26]。Smc5/6还可以作为人乳头瘤病毒（HPV）的抑制剂，可能是通过SMC6与HPV-31 E1之间的竞争性结合来实现[27]。这些观察结果表明，Smc5/6可能是一种普遍的病毒限制因子。
据报道，Smc5/6复合体通过三个步骤抑制HBV的转录。首先，Smc5/6依靠其ATP酶活性和NSMCE4A的功能捕获cccDNA。然后，Smc5/6-DNA复合体被SLF2招募到早幼粒细胞核小体中。第三步通过一种未知机制促进沉默，这一机制需要Nse2但不需要其SUMO连接酶活性[28]。因此，Smc5/6如何抑制HBV的机制尚未完全明了。在本研究中，我们建立了一种使用纯化Smc5/6蛋白测量转录活性的方法。我们的结果表明，除了Smc5/6全复合体外，NSMCE1/3亚复合体也足以在体外抑制萤光素酶的转录。此外，NSMCE1/3在细胞中在mRNA水平和蛋白质水平上都能抑制HBx的表达。NSMCE1/3通过20S蛋白酶体途径促进HBx的降解。这些结果为Smc5/6复合体抑制HBV的机制提供了见解。
部分内容
Smc5/6全复合体和亚复合体的纯化和表征
为了深入了解Smc5/6抑制HBV的分子机制，我们首先尝试获取Smc5/6蛋白。人类Smc5/6全复合体由六个亚基组成：Smc5–6和NSMCE1–4。其中，NSMCE2仅与Smc5的螺旋-线圈区域相互作用，而NSMCE1/3形成一个紧密的亚复合体（图1A）。据此，我们生成了三个pFastBac Dual载体，分别表达6his-TEV-NSMCE3/NSMCE1、6xhis-Flag-TEV-NSMCE2/Smc5和2xstrep-TEV-NSMCE4/Smc6（图1B）。
讨论
在本研究中，我们纯化了Smc5/6蛋白并建立了体外测定方法来研究Smc5/6对报告基因的转录抑制作用。出乎意料的是，除了Smc5/6全复合体外，NSMCE1/3亚复合体也表现出转录抑制活性，尽管效率较低。NSMCE1/3在mRNA水平和蛋白质水平上都能抑制HBx的表达。与NSMCE1/3共转染可以缩短HBx的半衰期，而敲低NSMCE1或NSMCE3则会
Smc5/6复合体的表达和纯化
pFastBac? Dual表达载体（Thermo Fisher）在一个载体中包含两个启动子，可以在昆虫细胞中同时表达两种蛋白质，使用Bac-to-Bac?杆状病毒表达系统。对于人类Smc5/6复合体，将带有N端TEV蛋白酶切割位点和Twin-StrepII标签的Smc6和NSMCE4A分别克隆到pFastBac双载体中，分别受杆状病毒多聚hedrin和p10启动子的控制。
CRediT作者贡献声明
何莉莉：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，方法学研究。沈环宇：撰写 – 原稿，可视化，研究。赵翱婷：可视化，研究。潘雨萱：可视化，研究，概念化。马俊：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，监督，资金获取。欧阳竹青：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，监督，资源提供，研究，概念化。
致谢
我们感谢Ryan Potts慷慨提供Smc5/6亚基的cDNA。本工作得到了国家自然科学基金（项目编号：32471272）的支持。
