创新的MgCl?介导的两步沉淀-溶解策略，用于高效纯化猪圆环病毒2型衣壳蛋白并实现类似病毒的颗粒自组装

高效纯化PCV2衣壳蛋白的策略研究：通过融合His标签、SUMO标签及自主NLS序列，结合200mM MgCl?沉淀-PBS再溶解体系，实现85%-87%高纯度回收，较传统方法成本降低且无需色谱柱，同时优化添加0.015%吐温80提高VLPs（18nm）储存稳定性。

　　

陈启伟|杜圆红|冯凌雅|杜廷瑞|孙洪旭|常艳红|罗慧

北京科技大学化学与生物工程学院生物科学与工程系，北京，100083，中国

摘要

在这项研究中，我们开发了一种简化的MgCl₂介导的沉淀-重溶策略，用于高效纯化猪圆环病毒2型（PCV2）衣壳蛋白。通过将PCV2衣壳蛋白与组氨酸标签（包含六个组氨酸残基）、小泛素样修饰因子（SUMO）标签和自体核定位信号（NLS）序列融合，系统地研究了它们在MgCl₂介导下的沉淀特性。在优化条件下——具体来说，使用200 mM MgCl₂进行沉淀，然后在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中重溶——该方案实现了优异的回收率和纯度。His-PCV2的纯度达到了85%，产率为82.8%，而His-SUMO-PCV2的纯度为87%，产率为82.1%。与传统的硫酸铵沉淀、固定化金属离子亲和层析（IMAC）和尺寸排阻层析（SEC）方法不同，这种无需色谱的技术消除了对昂贵树脂和复杂仪器的需求，从而显著提高了工艺效率。纯化的衣壳蛋白能够自发自组装成直径约为18 nm的结构完整的类病毒颗粒（VLPs）。值得注意的是，添加0.015%的Tween 80显著提高了VLPs的储存稳定性，这一点通过动态光散射（DLS）在4°C储存期间的监测得到了验证。作为首次将MgCl₂介导的两步沉淀-重溶策略应用于病毒衣壳蛋白纯化的案例，它为重组VLPs疫苗的生产提供了一种简单高效的替代方法，显示出大规模商业化的巨大潜力。

引言

随着工业生物技术和学术研究中对高纯度重组蛋白需求的不断增加，开发出稳健、可扩展且成本效益高的纯化方法变得十分必要[1]。虽然传统的纯化技术（包括盐析[2]、等电沉淀[4]和固定化金属离子亲和层析[5]）被广泛使用，但它们往往存在一些局限性，如操作流程繁琐、依赖昂贵的树脂或复杂的仪器设备，以及回收率和纯度不理想。因此，迫切需要无需色谱技术的纯化平台，以实现高通量和经济可行性。近年来，基于亲和作用的相分离方法利用融合标签成为了一种有前景的替代方案[6]。例如，弹性蛋白样多肽（ELPs）在温度变化时会经历可逆的聚集相变，从而促进蛋白质的回收[7]；然而，较大的ELP标签可能会对目标蛋白的表达和生物活性产生负面影响[8]。类似地，Park等人使用钙响应性钙调蛋白（CSQ）作为融合伴侣，通过调节钙浓度实现抗体的可逆沉淀，其杂质去除效果优于蛋白质A层析[9]、[10]。基于这些原理，我们的团队最近开发了阳离子亲和纯化（CAP）技术。该方法利用短聚组氨酸标签在低浓度的MgCl₂（10 mM）下选择性沉淀目标蛋白，然后在较高浓度（100 mM）下重溶，得到的纯度与Ni-NTA（镍-硝基三乙酸）亲和层析相当。通过将溶解样品稀释至10 mM MgCl₂可以重新诱导沉淀（沉淀-溶解循环的第二步），从而完成沉淀-溶解循环并实现蛋白质样品的浓缩。通过三步过程（沉淀-溶解-沉淀），成功制备出了高纯度的目标蛋白[11]。后续研究表明，其他基本氨基酸标签（赖氨酸、精氨酸或色氨酸）在MgCl₂溶液中也能表现出显著的沉淀效果，表明这种阳离子介导的策略具有广泛的适用性[12]。有趣的是，许多病毒衣壳蛋白天然含有富精氨酸的基序，如核定位信号（NLS）[13]，这些基序可能作为MgCl₂诱导沉淀的内源性标签。

NLSs是富含K/R的基本肽基序，通过与导入蛋白和核孔复合体的相互作用介导病毒成分的核内转运[13]、[14]。这些基序通常嵌入各种DNA病毒的衣壳或调节蛋白中，包括疱疹病毒科[15]、[16]、圆环病毒科[17]和喙羽病病毒（BFDV）[19]的成员。

20世纪90年代初，加拿大西部爆发了一种以断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）为特征的疾病[20]。病原体被确定为猪圆环病毒2型（PCV2），这是一种含有单链环状DNA基因组的小型无包膜病毒[21]。后续研究在美国、中国和其他几个国家的猪群中检测到了PCV2和PMWS[22]。PCV2属于圆环病毒科，现在被公认为是导致PMWS及多种相关疾病的主要病原体[23]、[24]、[25]，对全球养猪业造成了巨大的经济损失[26]、[27]、[28]、[29]、[30]、[31]、[32]、[33]。

PCV2衣壳蛋白是一种由开放阅读框2（ORF2）编码的约233个残基的多肽，其N端含有一个NLS（残基1–41），其中包含两个富精氨酸的基序：⁵RRRYRRRRHRPR¹⁶（NLS-A）和³³RHRYRWRRKN⁴²（NLS-B）[34]。NLS-B与其相邻的α-螺旋结构域（¹⁵PRSHLGQILRRRP²⁷）之间的相互作用对于衣壳蛋白在体外自发自组装成类病毒颗粒（VLPs）至关重要[34]。这些体外组装的VLPs的形态与天然PCV2病毒颗粒的二十面体对称性非常相似[35]。血清学研究表明，体外组装的PCV2 VLPs可以诱导高滴度的中和抗体，为仔猪提供针对同源PCV2基因型的有效保护[36]。基于自组装VLPs技术的商业PCV2亚单位疫苗（例如Ingelvac CircoFLEX）在降低病毒载量和减轻病毒引起的病变方面表现出显著效果，超过了传统灭活病毒疫苗的预防能力[37]、[38]、[39]。

本研究旨在结合组氨酸标签、PCV2衣壳蛋白的天然NLS序列以及MgCl₂介导的沉淀方法，建立一种新的基于沉淀的PCV2衣壳蛋白纯化策略。通过改造带有不同标签的PCV2衣壳变体，系统优化了沉淀-重溶参数。该基于MgCl₂的方案的性能与硫酸铵沉淀、IMAC和SEC进行了严格对比。此外，通过透射电子显微镜（TEM）和动态光散射（DLS）表征了纯化蛋白的结构完整性和自组装成VLPs的能力。最后，评估了Tween 80对VLPs配方的稳定作用，以确保其长期储存稳定性。

材料

胰蛋白胨和酵母提取物购自Thermo Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。所有化学试剂均为分析级，无需进一步纯化即可使用。DNA聚合酶来自Vazyme Biotech Co., Ltd.（中国南京）。限制性酶和NEBridge Golden Gate Assembly Kit（BsaI-HF v2）购自New England Biolabs, Inc.（美国马萨诸塞州伊普斯威奇）。质粒提取和PCR产物纯化试剂盒来自Sangon Biotech Co., Ltd.

NLS-GFP和NLS-DsRed的MgCl₂依赖性沉淀特性

PCV2衣壳蛋白的NLS区域富含精氨酸（41/42个残基中约有30个精氨酸）[34]。这种高电荷密度有助于二价金属离子通过阳离子-π相互作用和静电桥接[40]，从而触发蛋白质沉淀[11]。在这项研究中，我们研究了NLS作为Mg²⁺诱导沉淀的纯化标签的有效性。

结论

在这项研究中，我们创新性地利用了PCV2衣壳蛋白中天然的富精氨酸核定位信号（NLS），开发了一种基于阳离子亲和沉淀（CAP）的快速、可扩展的纯化策略。通过对关键参数的系统优化，发现使用200 mM MgCl₂进行沉淀可以获得优异的结果：His-PCV2的纯度为85%，产率为82.8%；His-SUMO-PCV2的纯度为87%，产率为82.1%。这种无需色谱的技术

CRediT作者贡献声明

陈启伟：撰写初稿、方法学设计、实验研究、数据分析、数据管理。杜圆红：撰写初稿、方法学设计、实验研究、数据分析、数据管理。冯凌雅：实验研究、数据分析、数据管理。杜廷瑞：实验研究、数据分析、数据管理。孙洪旭：撰写、审稿与编辑。常艳红：撰写、审稿与编辑。罗慧：撰写、审稿与编辑、资源获取、概念构思。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号：22078019）和中央高校基本科研业务费（编号：FRF-BR-23-02B）的支持。