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鸡LAMP1多克隆抗体制备及慢性热应激对肝脏影响研究。通过原核表达纯化重组鸡LAMP1蛋白并成功制备特异性抗体，验证其通过WB/IHC/IF等技术在肝、肾组织中的特异性检测。对36只肉鸡进行慢性热应激（35天每日12小时37℃）研究发现，热应激显著降低肝脏LAMP1表达，伴随肝酶升高和抗氧化能力下降，揭示LAMP1在热应激诱导肝损伤中的潜在作用。该研究建立了首个鸡源LAMP1特异性检测工具，为热应激下胞内降解途径机制研究提供新方法。
Jingyan Luo|Yan Shi|Xi Jiang|Bingqing Zhang|Yunfeng Chen|Liling Liu|Ping Liu|Gaofeng Cai|Zhanhong Zheng|Xiaoquan Guo|Xiaona Gao
江西农业大学动物科学与技术学院动物健康重点实验室，中国江西省南昌市
摘要
溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1）是一种关键的溶酶体结构标志物，参与细胞应激反应。热应激（HS）是家禽生产中的主要挑战，会导致肝脏损伤，但由于缺乏针对鸡的特异性抗体，LAMP1在慢性热应激中的作用尚未得到研究。本文开发了一种针对鸡LAMP1的多克隆抗体，并用其研究了慢性热应激下的肝脏反应。生物信息学分析鉴定了鸡LAMP1中的多个抗原表位、信号肽和跨膜结构域（GenBank ID：396220）。在大肠杆菌中表达的重组LAMP1在兔子体内产生了高滴度的抗体（≥1:409600）。通过Western blotting、免疫组化、免疫荧光以及DF-1细胞中的Si-LAMP1敲低实验验证了抗体的特异性，证实了LAMP1在肝脏和肾脏中的存在。36只宁都三黄肉鸡分别处于对照组（24±2°C）和慢性热应激组（37±2°C，每天12小时，持续35天）。慢性热应激导致了肝脏损伤，表现为AST和ALT水平升高以及抗氧化能力（T-AOC）下降。重要的是，热应激组肝脏中的LAMP1表达显著下调，这表明LAMP1可能参与了热诱导的溶酶体功能障碍。本研究为鸡LAMP1的研究提供了一种高度特异性的工具，并揭示了慢性热应激与肉鸡肝脏中溶酶体蛋白调节之间的新联系，为减轻家禽热诱导的肝脏损伤提供了机制上的见解。
引言
溶酶体是酸性细胞器，含有多种水解酶，能够通过内吞作用或吞噬作用降解细胞外物质，以及通过自噬作用降解细胞内成分[1]。它们对细胞稳态至关重要，参与凋亡、自噬和坏死等关键过程[2]。在溶酶体蛋白中，溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1）被广泛认为是溶酶体的典型标志物和溶酶体膜的关键结构成分。LAMP1由一个大的腔内结构域、一个跨膜段和一个短的C端细胞质尾组成，这些结构参与溶酶体的定位和与其他细胞器的融合[3],[4],[5],[6]。LAMP1与LAMP2以及其他溶酶体膜蛋白（如溶酶体整合膜蛋白-2（LIMP-2）和CD63）一样，经过广泛的糖基化修饰，形成一层保护性的糖萼，防止溶酶体自我降解并维持细胞器的完整性[5],[6]。尽管LAMP1阳性结构可以定位在多种细胞器中，包括自噬溶酶体、内体、多囊泡体和多层囊泡体，但由于其在细胞内降解中的功能作用，它们主要被认为是溶酶体[7],[8]。
细胞应激条件可以调节LAMP1的表达和溶酶体活性。例如，在急性胰腺炎中，LAMP1在早期应激阶段表达下调，随后在TFEB介导的溶酶体激活后上调[9]。类似地，饮食应激会触发大鼠卵巢中的自噬，伴随LAMP1表达的增加[10]，神经元研究显示LAMP1在自噬溶酶体和溶酶体细胞器之间动态分布以维持细胞稳态[11]。这些观察表明，LAMP1不仅作为溶酶体标志物，还积极参与细胞应激反应。
热应激（HS）是家禽生产面临的主要环境挑战，尤其是在全球变暖的背景下[12],[13]。由于家禽的新陈代谢率高、羽毛覆盖和缺乏汗腺，它们对高温非常敏感，这限制了它们有效散热的能力[14]。热应激会引起氧化应激，破坏线粒体和溶酶体功能，并损害肉鸡肝脏的自噬[15]。哺乳动物模型的研究还表明，热应激及相关应激因素会损害神经元和精子发生细胞的溶酶体活性[16],[17]。然而，慢性热应激对家禽肝脏中溶酶体功能尤其是LAMP1表达的影响仍知之甚少。
研究家禽溶酶体反应的一个关键障碍是缺乏针对鸡的特异性LAMP1抗体。大多数市售抗体是针对哺乳动物蛋白验证的，可能无法识别鸟类的表位，因为蛋白质结构和糖基化存在物种差异。解决这一问题是实现家禽应激条件下溶酶体功能研究的关键。
为了克服这一限制，我们使用原核表达系统表达了重组鸡LAMP1蛋白，并在兔子体内产生了多克隆抗体。然后通过Western blotting（WB）、免疫组化（IHC）和免疫荧光（IF）验证了这些抗体的特异性和敏感性。最后，我们利用这一工具研究了暴露于慢性热应激下的肉鸡肝脏中的LAMP1表达。这项研究不仅为鸟类溶酶体研究提供了高度特异性的试剂，还为热应激诱导的肝脏损伤中LAMP1和溶酶体调节的作用提供了新的见解，对家禽健康和管理具有重要意义。
部分摘录
动物模型构建和样本收集
共36只宁都三黄鸡根据体重随机分配到对照组（Con）或热应激组（HS），每组3个重复笼子，每个笼子6只鸡。笼子位置通过随机数表随机分配，以尽量减少位置效应。对照组在24±2°C的稳定环境中饲养，可自由获取食物和水。热应激组每天暴露在37±2°C的环境中12小时（从8:00到20:00），
鸡LAMP1蛋白的生物信息学分析结果
为了更好地了解鸡LAMP1的结构和功能特征，进行了生物信息学分析。信号肽预测显示存在一个N端信号肽，支持其向膜定位的转运途径（图1a）。TMHMM分析鉴定出一个跨膜螺旋结构（位置约350–370），证实LAMP1是一种膜蛋白（图1b）。疏水性分析表明序列中存在交替的亲水区和疏水区（范围：-0.5到2.0），
讨论
肉鸡对环境热应激非常敏感，这对家禽生产构成了严重挑战，并导致了全球范围内的重大经济损失[18]。虽然先前的研究表明热应激会引起氧化损伤并损害肝脏功能[19],[20]，但慢性热应激对溶酶体活性，特别是肉鸡肝脏中LAMP1表达的影响尚未得到研究。本研究首次证明，慢性热应激会导致LAMP1表达显著下降
结论
总之，本研究表明慢性热应激会导致肉鸡肝脏中LAMP1表达下降，表明溶酶体功能障碍、氧化应激和肝脏损伤之间存在关联。开发出一种高度特异性和强效的鸡LAMP1多克隆抗体，有助于精确研究鸟类的溶酶体生物学，并为未来的研究提供了宝贵的工具。这些发现增强了我们对鸟类细胞应激反应的理解。
作者贡献声明
Jingyan Luo：撰写——原始草稿、可视化、方法学、数据分析、概念化。Yan Shi：验证、数据分析。Xi Jiang：验证、数据分析。Bingqing Zhang：验证、数据分析。Yunfeng Chen：验证、数据分析。Liling Liu：可视化、数据分析。Ping Liu：撰写——审阅与编辑、监督、方法学。Gaofeng Cai：撰写——审阅与编辑、监督、方法学。Zhanhong Zheng：撰写——审阅与编辑，
资助
本研究得到了国家自然科学基金（32202880和32560883）、江西省科技计划（20224BAB215056）、国家重点研发计划（2023YFD1801100）、江西省现代农业禽业技术体系（JXARS）和江西省重点研发计划（20224BBF62003）的支持。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
