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本文介绍了一种新型骨多细胞单元芯片（BMU-Chip）平台的设计、构建与验证。该平台集成了骨细胞、成骨细胞和破骨细胞，能够在长达31天的时间内，对三维骨细胞网络施加周期性脉冲单向流体刺激（PUFFS），并实时观察钙信号（Ca2+）传导。该模型克服了传统离体和体外模型的诸多局限，为研究骨骼机械适应、骨重塑（bone remodeling）的细胞间对话及骨相关疾病（如骨质疏松症）的机制，提供了一个高度模块化、生理相关性更强的实验工具。
骨骼通过一个名为骨重塑的持续过程来维持其结构完整性。这个过程的基本功能单位是骨多细胞单元，它是由骨细胞、成骨细胞和破骨细胞组成的高度有序复合体。骨细胞是骨骼中的主要机械感觉细胞，它们被包裹在矿化的、富含胶原的基质中，通过庞大的骨小管-骨小腔网络相互连接，并连接到效应细胞。当骨骼承重时，骨细胞感知基质变形和间质液流动，并通过间隙连接快速传递生化和离子信号，以协调成骨细胞和破骨细胞的时空活动，从而适应骨骼所受应力并维持稳态。骨细胞机械转导缺陷与多种骨骼疾病相关，包括骨质疏松症、骨关节炎、骨转移瘤、先天性骨病、骨折愈合和无菌性假体松动。为了开发和验证促进骨骼健康的新治疗干预措施，必须理解瞬时的机械诱发信号如何驱动由骨细胞、成骨细胞和破骨细胞组成的骨多细胞单元内持久的机械适应性重塑。
然而，大多数关于骨细胞机械生物学的研究都集中在机械诱发的钙瞬变上。传统的直接可视化研究依赖于对活骨外植体或动物模型进行短期机械负荷下的成像，这需要复杂的仪器、侵入性手术准备以及加载和成像设备，成本高昂，伦理存疑，且观察期短。此外，矿化骨骼的不透明性质阻碍了观察深层荧光钙探针所需波长的光穿透。同样，常规的体外二维培养模型，无论是单纯的骨细胞单层培养，还是与成骨/破骨细胞共培养的流体剪切或纳米压痕模型，都无法复制体内骨多细胞单元的三维结构和细胞复杂性，特别是至关重要的三维骨小管-骨小腔网络。虽然已有使用矿化三维支架、羟基磷灰石颗粒和水凝胶的模型来模拟三维骨细胞网络，但这些模型与天然骨骼一样不透明，限制了实时观察信号活动的深度，并且通常与进行纵向实验所需的延时成像方法不兼容。
为突破这些局限，本研究旨在设计并验证一种新型的骨多细胞单元芯片平台。该平台的核心目标包括：对三维骨细胞网络施加长达30天以上的脉冲单向流体刺激；能够在用户定义的时间点，在特定腔室中与成骨细胞和/或破骨细胞进行共培养；能够利用标准评估方法实时检测钙信号等即时响应，以及细胞活力、形态、蛋白和基因表达等长期结果。
设计与制造采用3D打印母模的多腔室芯片
该芯片的设计与制造过程采用了投影立体光刻技术和软光刻技术。首先，使用投影立体光刻技术打印聚乙二醇二丙烯酸酯母模，然后通过复制铸造、热固化和等离子体键合到玻璃盖玻片上，最终制成聚二甲基硅氧烷芯片。制成的芯片包含一个中央腔室和两个侧腔室，各腔室均有入口和出口端口。中央腔室用于容纳包裹在三维胶原凝胶中的骨细胞，一个侧腔室用于在特定时间点接种模型效应细胞，另一个侧腔室则用于施加每日的脉冲单向流体刺激。芯片表面经过聚多巴胺、聚赖氨酸和胶原涂层处理，以促进细胞附着和功能。
结果
骨细胞成熟与活力在骨多细胞单元芯片中得以维持并被脉冲单向流体刺激增强
研究选用了条件永生化的小鼠骨细胞样细胞系OCY454。这些细胞在许可温度下增殖，在限制性温度下则进入有丝分裂停滞并启动向终末分化骨细胞的成熟，其成熟过程可通过由DMP1启动子控制的绿色荧光蛋白报告基因表达来追踪。实验将OCY454细胞悬浮在胶原中接种到芯片中央腔室，随后转移到生长限制温度条件以启动成熟，并接受每日脉冲单向流体刺激或静态处理。
活死染色显示，在整个观察期间，两种条件下的细胞活力均得以保持。在静态条件下，DMP1表达在整个观察期内逐渐增加，至第31天达到峰值，表明该骨多细胞单元芯片方法支持骨细胞分化。而暴露于每日脉冲单向流体刺激的芯片则显示出更高的初始DMP1表达水平，在第19天达到类似峰值，并在之后保持大致恒定。这表明脉冲单向流体刺激加速了骨细胞成熟，与使用各种二维、三维和体内模型系统的其他研究发现一致。此外，一些骨细胞被观察到从胶原基质迁移到侧腔室中，但这些迁移的细胞在第31天显示出极低水平的DMP1-GFP报告基因表达，这可能表明离开三维环境会暂停其沿成骨细胞-骨细胞连续体的进展。
与成骨细胞共培养可减弱受脉冲单向流体刺激骨细胞的成熟
为了更接近地模拟体内骨多细胞单元及机械刺激下的细胞间通讯，研究评估了将成骨细胞样MC3T3-E1.4细胞纳入骨多细胞单元芯片平台的情况。在静态条件下，与成骨细胞共培养的骨细胞，其DMP1表达轨迹与骨细胞单一培养相似，表明成骨细胞的单纯存在不会改变骨细胞的成熟速率。然而，在脉冲单向流体刺激条件下，与成骨细胞共培养似乎减弱了骨细胞的成熟，DMP1-GFP报告基因表达在第19天达到峰值，随后逐渐回落到基线水平。这一发现似乎与先前的一项研究结果一致，该研究报告在与人原代成骨细胞的共培养系统中，人原代骨细胞的DMP1表达显著降低。
单培养和共培养条件下的细胞形态
通过细胞核和细胞骨架染色评估了细胞形态。在受脉冲单向流体刺激的骨细胞单独培养芯片及骨细胞与成骨细胞共培养芯片的整个图像堆栈中，均观察到了细胞薄片结构，而静态对照芯片中未观察到这些结构。机械负荷已被证明可以激活增强骨细胞连接和基质/细胞骨架相互作用的物理和生化线索。在成骨细胞单独培养芯片中，成骨细胞附着在底部和顶部，并迁移到中央腔室的胶原中。在共培养条件下，产生了类似的密集网络，但与骨细胞单独培养芯片相比，其侵入侧腔室的程度较小。在某些位置，还观察到了中央腔室内骨细胞的树突状延伸。
连续样本采集方法允许在单培养和共培养条件下平行评估不同细胞群的基因表达
研究设计了一个连续采集方法，从每个通道回收样本，以对一组成骨细胞和骨细胞标记基因进行平行分析。作为概念验证实验，数据显示了在每日脉冲单向流体刺激下，在装置中培养31天后细胞表型的基因表达水平。骨桥蛋白在成骨细胞和骨细胞单培养中均有表达，且在共培养条件下表达最高。骨保护素在所有培养配置中检测到的水平相似。研究承认，在成骨分化培养基中包含地塞米松是这些实验中的一个主要混杂因素，因为它直接影响许多成骨基因的表达。尽管如此，这些结果强化了该实验平台与基因表达分析的兼容性，能够从芯片的不同通道分离不同细胞群的RNA，允许从单个实验中进行平行评估。
关键标记物的免疫组化表达
免疫组化染色用于探测整个装置中细胞标记蛋白的表达，如绿色荧光蛋白和Runt相关转录因子2。正如预期，骨细胞单独培养芯片在中央腔室中表达高水平的绿色荧光蛋白。在成骨细胞单培养中，在侧腔室和侵入中央腔室的细胞中均观察到Runx2表达，而未检测到绿色荧光蛋白。在共培养物中观察到类似的Runx2染色模式，尽管迁移到中央腔室的成骨细胞较少。在骨细胞单培养和共培养芯片中，绿色荧光蛋白染色主要定位于中央腔室，尽管在一些迁移出三维环境的细胞中也观察到染色。有趣的是，一些迁移到侧腔室的骨细胞单培养芯片中的细胞显示出Runx2染色，这可能表明它们尚未被诱导向骨细胞分化，或者已去分化到更原始的成骨细胞状态。重要的是，在任何实验中，Runx2和绿色荧光蛋白信号均未在单个细胞中共定位，表明免疫染色程序具有高度严格性。
钙信号的实时监测
在单培养和共培养芯片上进行每日脉冲单向流体刺激，并在第31天使用时差共聚焦显微镜捕获钙信号。对于共培养芯片，谱图显示在三次脉冲单向流体刺激期间骨细胞活性很高，细胞试图匹配刺激频率。此外，在脉冲单向流体刺激期间，从靠近刺激的区域到远离刺激的区域，骨细胞活性逐渐降低，而侧腔室记录的活性最低。对于成骨细胞单独培养芯片，未检测到细胞活性；对于骨细胞单独培养芯片，观察到从近端到远端区域细胞活性降低的类似趋势。结果表明，中央腔室中的细胞比侧腔室中的细胞更活跃。记录到的信号可能是三维骨细胞和任何迁移到中央腔室的成骨细胞的组合，这在本实验中无法区分。除了刺激诱发的钙信号活动，在一些细胞中也观察到了自发的钙信号活动。根据先前工作，芯片中央腔室中负载细胞的胶原将承受从靠近刺激区域的56.17千帕到远离刺激区域的11.23千帕变化的应力，这可以解释在靠近施加脉冲单向流体刺激的中央腔室中检测到更大的钙信号，也解释了远离刺激的侧腔室中成骨细胞缺乏钙信号活动。尽管在骨细胞单独培养芯片中观察到一些活性，但远低于骨细胞与成骨细胞共培养芯片，表明共培养条件对于该模型感知脉冲单向流体刺激是必要的。这一结果与其他研究一致，这些研究表明共培养的成骨细胞-骨细胞对机械刺激的钙信号和反应性比单培养增强。
顺序共培养芯片与模型破骨细胞的表征
在第31天，使用稀释的胰蛋白酶溶液去除侧腔室中的细胞，然后将前破骨细胞RAW264.7细胞接种到该腔室中，并在每日脉冲单向流体刺激和静态对照条件下使用破骨细胞培养基培养3天。在第34天对细胞形态和破骨细胞分化进行表征。复合明场和荧光图像显示，在脉冲单向流体刺激和静态对照条件下，中央腔室中负载骨细胞的胶原凝胶内均有DMP1-GFP表达。使用活死染色评估的芯片内细胞活力显示，在第34天，脉冲单向流体刺激和静态对照组均具有高细胞活力，组间无显著差异。基于细胞骨架和细胞核染色的细胞形态显示，侧腔室中的RAW264.7细胞具有多个细胞核，表明在芯片内发生了破骨细胞分化。抗酒石酸酸性磷酸酶阳性染色也证实了芯片内存在破骨细胞特异性活性。与脉冲单向流体刺激芯片相比，静态培养条件下的抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞表现出细胞面积增加，尽管差异不显著。使用实时荧光定量聚合酶链反应对与破骨细胞吸收依赖性粘附和分化相关的基因进行了表征。组间在抗酒石酸酸性磷酸酶或整合素β3表达上无显著差异。而活化T细胞核因子c1和核因子κB受体活化因子表达的显著变化，指向了芯片侧腔室内破骨细胞的分化。研究人员推测，破骨细胞中活化T细胞核因子c1表达的这一发现，可能反映了机械负荷对先前与成骨细胞一起培养的骨细胞分泌活动的长期预调节效应。
讨论
复制骨骼重塑的终极目标是，将动态机械刺激与机械传感骨细胞、骨形成成骨细胞和骨吸收破骨细胞的培养结合到一个单一的集成模型中。在早期工作中，研究团队建立了一个简单的骨细胞机械转导微流体单培养模型，其中使用活细胞荧光显微镜评估了长达两周的生理相关脉冲单向流体刺激下，胶原包裹的小鼠骨细胞自组装三维网络中钙信号传播的情况。与静态模型或简单的单层流体剪切模型不同，脉冲单向流体刺激通过提供间质液流动和基质变形梯度，更好地模拟体内机械刺激，从而激活骨细胞整合的不同机械转导通路，以协调成骨细胞和破骨细胞的机械适应性活动。
本研究在初始设计的基础上，提出了一个更先进的多细胞单元芯片模型，该模型将成骨细胞和破骨细胞与三维胶原基质包裹的骨细胞网络整合在一起，并能够研究机械力转导为骨代谢反应的机制，这些反应进而决定骨骼结构和材料特性。当前工作通过建立共培养和分阶段顺序共培养模型的关键参数、前成骨细胞和前破骨细胞的原位分化，以及在每日脉冲单向流体刺激下长达一个月的时间内持续表达每种细胞系的典型关键功能标记，验证了该方法的可行性。骨重塑是一个紧密耦合的过程，其中破骨细胞和成骨细胞在骨转换的任何单个点以特定顺序而非同时运作。受先前工作指导，骨细胞单独培养芯片被允许在胶原中建立稳健连接9天，然后才向芯片中添加任何其他细胞。为了模拟骨重塑期间观察到的顺序耦合，在第9天将成骨细胞添加到侧腔室，在成骨条件下培养，并接受脉冲单向流体刺激直至第31天，以模拟骨重塑的骨形成阶段。在第31天，胰蛋白酶消化去除成骨细胞，然后添加破骨细胞以模拟重塑的吸收阶段。后期添加破骨细胞部分是由于实际考虑，因为RAW264.7细胞增殖迅速，会迅速过度生长。由于本工作的重点是展示在用户定义的时间/序列向/从特定腔室添加和去除相关细胞的能力，因此没有测试与在引入破骨细胞之前用成骨细胞预处理骨细胞芯片的影响相关的具体假设，尽管这可以在未来的实验中进行测试。这为实验设计提供了高度的模块化。该芯片还提供了对细胞微环境的时空控制。
除了添加成骨和破骨细胞外，在建立先进的多细胞单元芯片模型时还进行了几项关键改进。当前工作选择了条件永生化骨细胞系OCY454，它在许可温度下维持增殖，但在37°C时进入停滞的静息状态，允许进行纵向活细胞和时差实验。此外，OCY454细胞系表达由DMP1启动子驱动的成熟依赖性绿色荧光蛋白报告基因，现已被证明可以被机械刺激加速。同样，在该模型系统中，骨细胞的长时期单培养，或与成骨细胞的共培养，以及在长时间机械刺激下与核因子κB受体活化因子配体诱导的破骨细胞的异步顺序共培养，都保留了每种谱系的关键标记物表达。早期研究使用了2.5毫克/毫升的胶原浓度，这允许快速建立连接相邻细胞的骨小管-骨小腔网络，但在超过14天的实验中经常从微流体装置上剥离，并且允许成骨细胞过度迁移到胶原基质中。为了解决这个问题，在当前研究中，增加了用于在制备多细胞单元芯片装置初始步骤中悬浮骨细胞的胶原浓度，这在不影响三维网络自组装的情况下，更好地保留了骨细胞-成骨细胞界面，并且在长期研究或酶促细胞去除后没有发生剥离。
虽然这项工作侧重于验证一个允许研究三种主要骨细胞类型相互作用的模型，但研究人员设想该平台的未来迭代将整合代表血管、神经、造血和骨髓基质谱系的额外细胞谱系，以更忠实地再现骨骼微环境。此外，可以动态调节脉冲单向流体刺激的参数，以复制从高负荷和高强度运动到模拟久坐生活方式甚至模拟废用性骨量减少的细胞生物学的机械转导刺激，并且可以结合药理学干预措施。
与所有还原论模型一样，多细胞单元芯片也有局限性。在这些芯片中共培养细胞的理想培养基成分仍然是一个关键挑战，因为培养基通过胶原扩散会发生，可能对某些细胞类型不利。此外，虽然非矿化和透明的胶原基质允许使用时差显微镜捕获脉冲单向流体刺激期间的动态钙信号响应，但未来的研究应考虑矿化的作用。可以优化与成骨细胞的培养条件，使其在添加前破骨细胞之前能够进行矿物沉积，或者中央腔室中的胶原可以用模拟体液人工矿化，然后接种和培养破骨细胞以研究破骨细胞生成。该模型使用稀释的胰蛋白酶溶液去除侧腔室中的细胞，这些清洗步骤对芯片各腔室内细胞的影响可以系统地表征。最后，使用人源细胞代替模型细胞可以显著推进对骨细胞机械转导及其在骨重塑中作用的理解。
总而言之，当前的多细胞单元芯片在传统体外模型的实验灵活性和通量，与动物模型的生理相关性和实验挑战之间取得了平衡。通过整合三种主要骨细胞和定义的周期性负荷条件，研究团队建立了一种系统方法来研究与骨重塑相关的复杂细胞对话，特别是对机械刺激的响应。与二维培养不同，该芯片将骨细胞包裹在胶原基质中，在培养期间自组装成三维互连网络。该工作的一个关键特性是其模块化。细胞接种和脉冲单向流体刺激的应用都可以从任意侧腔室进行。微流体芯片提供了对微环境的精确时空控制，允许研究特定的细胞相互作用和信号通路。短期来看，该芯片可用于研究骨重塑周期的独立阶段；长期来看，研究人员设想完整再现骨重塑周期，并有可能用于药物筛选。通过阐明骨细胞如何响应机械负荷协调成骨细胞和破骨细胞的活动，此类模型与人源细胞结合时，可以识别涉及异常机械转导的骨骼疾病的新机制，并减少对动物模型的依赖。
