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本研究针对肝细胞癌(HCC)中O-连接β-N-乙酰葡糖胺(O-GlcNAc)修饰的关键作用，开发并应用了一套整合化学酶法标记、光裂解富集与串联质谱标签定量的位点特异性定量蛋白质组学工作流程。该方法在临床组织中首次实现了高通量、高精度的O-GlcNAc位点鉴定与定量，成功揭示了HCC中O-GlcNAc修饰的全局性上调特征及其在核转运、染色质重塑与转录调控等致癌过程中的潜在功能，为深入理解O-GlcNAc糖基化在肝癌发生发展中的作用机制及寻找新型治疗靶点和生物标志物提供了重要的数据资源和研究基础。
实验设计与工作流程
为深入研究O-GlcNAc修饰在肝细胞癌(HCC)发病机制中的作用，本研究设计并应用了一套整合的定量蛋白质组学工作流程。考虑到蛋白质丰度的变化可能影响O-GlcNAc修饰水平，研究对总蛋白和O-GlcNAc肽段进行了平行定量分析。总蛋白分析使用20微克蛋白，在无标记数据非依赖采集模式下进行定量蛋白质组学分析。O-GlcNAc蛋白质组学分析则使用了4毫克蛋白，经过GalT1(Y289L)介导的化学酶法标记和基于光裂解生物素炔烃探针的富集。富集到的O-GlcNAc肽段用TMT10plex试剂进行标记，以最大化O-GlcNAc覆盖度，标记后的肽段经高pH反相色谱分为8个组分，每个组分通过纳升级超高效液相色谱-串联质谱系统，在HCD产物依赖性电子转移/高能碰撞解离模式下进行分析，用于O-GlcNAc位点定位和基于报告离子的定量。定量得到的O-GlcNAc修饰水平经过对应蛋白质丰度的归一化处理，用于比较HCC与正常组织间的差异。
HCC与正常组织中O-GlcNAc修饰谱分析
应用上述工作流程，研究人员对四例HCC和四例正常肝组织样本进行了比较分析。总蛋白质组学分析共鉴定和定量了6,888个蛋白质组。其中，683个蛋白质在HCC中上调，195个下调。基因本体富集分析表明，上调蛋白质主要与RNA剪接和核糖体调控相关，而下调蛋白质则主要参与氨基酸代谢等过程。
在O-GlcNAc谱分析方面，在所有样本中鉴定的1,917条肽段中，有602条肽段含有特征性的质量增加（+731.364 Da）。经过对丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基上修饰的过滤，最终确定了440条O-GlcNAc肽段。总共在196个蛋白质上高置信度地定位了305个O-GlcNAc糖基化位点。与先前在肝母细胞瘤中使用O-GlcNAc抗体珠富集的研究相比，本策略新发现了291个O-GlcNAc修饰位点。许多低丰度的转录共激活因子和转录因子被鉴定为O-GlcNAc修饰，例如在肝细胞癌发展中起基础调控作用的核受体共激活因子6。
HCC与正常组织间O-GlcNAc位点占有的改变
在440条已鉴定的O-GlcNAc肽段中，有390条成功通过TMT报告离子强度进行了定量，从而能够稳健地比较HCC与正常肝组织间的O-GlcNAc修饰模式。O-GlcNAc肽段的丰度首先在各组内通过分位数归一化进行校正，然后进一步根据总蛋白质组定量获得的对应蛋白质水平进行调整。经过对数转换后，所有样本的归一化O-GlcNAc肽段定量值用于主成分分析。HCC和正常样本在基于t分布的置信椭圆下清晰地分为两个簇，这表明与恶性肿瘤相关的O-GlcNAc修饰景观发生了显著的全局性变化。层次聚类热图也显示，O-GlcNAc修饰在HCC中普遍上调，且样本按生物学分组聚类。
进一步的差异分析显示，在HCC组中，有190条来自121个蛋白质的O-GlcNAc肽段显著上调。一个重要的例子是mTORC1的核心组成部分——mTOR调节相关蛋白的T700位点被鉴定为O-GlcNAc修饰。尽管该蛋白质本身的水平仅略有增加，但在HCC中发现的RPTOR O-GlcNAc修饰水平却高达对照样本的8.5倍。在归一化至蛋白质水平变化后，RPTOR T700位点的O-GlcNAc占有仍观察到约5.3倍的增加。对另外三对正常和HCC裂解物中RPTOR的免疫共沉淀实验进一步验证了这一发现，显示在HCC中RPTOR的O-GlcNAc修饰水平显著更高，而蛋白质丰度相当。已有研究表明，RPTOR T700的O-GlcNAc修饰可增强其与Rag GTPases的相互作用，促进mTOR向溶酶体表面转运，从而激活mTORC1。因此，RPTOR上的O-GlcNAc修饰对于调控mTORC1这一感知营养信号、协调细胞生长的关键枢纽至关重要。
发生改变的O-GlcNAc蛋白质的功能分类
对121个O-GlcNAc修饰显著增加的蛋白质进行基因本体和KEGG通路富集分析，以深入了解其生物学意义。这些蛋白质主要与核相关的生物过程有关，包括核输入、核质转运、核孔组织等。在分子功能上，它们高度参与核转运、转录调控、核受体相互作用、信号序列识别和转录共激活等。KEGG通路富集分析则强调了它们在核质转运和ATP依赖性染色质重塑中的参与。已知ATP依赖性染色质重塑对调控基因表达至关重要，并与癌症发展密切相关。
为了进一步探索这些O-GlcNAc修饰蛋白质之间潜在的协调和功能相互作用，研究利用STRING数据库构建了蛋白质-蛋白质相互作用网络。结果显示，这些蛋白质高度参与基因表达的负调控、染色质修饰、翻译调控、mRNA运输以及内质网到高尔基体的囊泡介导运输等过程。许多O-GlcNAc蛋白质（如STAT3、RPTOR和NCOR1）可能彼此相互作用，表明它们在HCC发展中的信号转导和转录调控方面具有潜在的协同作用。
N-GlcNAc修饰的特征
此前研究发现，化学酶法标记方法能够检测到某些蛋白质天冬酰胺残基上的N-连接N-乙酰葡糖胺单糖修饰。在本研究数据集中，总共在118个蛋白质的152个天冬酰胺残基上高置信度地鉴定到了GlcNAc修饰。在归一化至蛋白质水平后，有十个N-GlcNAc位点在对照和HCC样本间发生了显著变化，其中八个在HCC组中显著上调，两个显著下调。例如，在细胞外基质重要成分原纤蛋白-1的N1067位点鉴定到了GlcNAc修饰。尽管蛋白质水平下降了约40%，但在HCC中该位点的N-GlcNAc修饰却增加了约2.4倍，导致N1067位点的GlcNAc占有增加了约4.3倍。有趣的是，虽然原纤蛋白-1的另外两个位点也被GlcNAc修饰，但未观察到显著变化，这表明同一蛋白质上多个位点的N-GlcNAc修饰占有存在差异。作为首个定量N-GlcNAc蛋白质组学研究，本工作提示了蛋白质N-GlcNAc修饰在HCC发展中的潜在作用，但其在生理和病理中的功能重要性仍有待阐明。
结论
本研究通过结合化学酶法富集和基于TMT的定量蛋白质组学方法，对肝细胞癌中的O-GlcNAc修饰景观进行了表征。该工作流程鉴定了440条O-GlcNAc肽段，代表了196个蛋白质上的305个位点。其中，来自121个蛋白质的190条O-GlcNAc肽段在HCC中显著上调。对这些蛋白质的功能注释和蛋白质-蛋白质相互作用图谱分析，强调了它们参与信号转导、核质转运和转录调控等过程。这一全面的数据集为O-GlcNAc糖基化的致癌作用提供了新的见解，并为肝癌的机制和转化研究奠定了宝贵的基础。
