《Frontiers in Genetics》：Promoter hypomethylation of CDH7: a novel epigenetic marker associated with cerebral small vessel disease
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本研究通过对脑小血管病（SVD）患者外周血炎症细胞进行全基因组启动子甲基化分析，鉴定出CDH7基因启动子低甲基化是SVD影像学特征（如白质高信号、腔隙性脑梗死、脑微出血）的独立表观遗传标志物。该标志物结合高龄和高同型半胱氨酸血症，在分层逻辑回归和深度学习模型中均能有效预测SVD，尤其与腔隙性梗死独立相关，为SVD的风险分层提供了潜在的生物标志物和新机制见解。
1. 引言
脑小血管病（SVD）是一种常见的脑血管疾病，在磁共振成像（MRI）上表现为白质高信号（WMH）、腔隙性脑梗死和脑微出血。SVD是血管性认知障碍、脑出血和缺血性卒中（IS）的重要病因。遗传因素被认为是SVD的关键贡献者，全基因组关联研究（GWAS）已发现多个与SVD影像特征相关的基因位点，但这些变异仅能解释WMH方差的大约29%。表观遗传调控，特别是基因启动子区的DNA甲基化，是连接遗传背景、环境暴露和衰老相关血管损伤的合理生物学环节。启动子甲基化分析有助于识别反映血管风险因素和衰老累积效应的SVD表观遗传标志物。然而，与SVD影像特征（包括腔隙和脑微出血）相关的表观遗传标志物仍未得到充分探索，这限制了对疾病发生和发展的理解。为了应对这些挑战，本研究采用极端表型设计来增强表观遗传谱的对比。
2. 材料与方法
本研究分为三个步骤：基于SVD患者外周血炎症细胞进行表观基因组关联分析（EWAS）；鉴定与SVD影像特征相关的靶基因特异性启动子甲基化CpG位点；在缺血性卒中患者队列中验证这些甲基化变化作为表观遗传标志物。研究对象来自一项关于缺血性卒中患者卒中复发和抗血小板抵抗关系的多中心前瞻性队列研究（STRAPER研究）的参与者，最终纳入766名患者。通过MRI评估SVD影像特征，包括腔隙、WMH和位于皮质和/或皮质的脑微出血。从STRAPER队列中，选择了16名具有所有三种SVD影像特征（全-SVD组）的患者和16名没有任何影像特征（无-SVD组）的患者，使用Infinium MethylationEPIC v2.0芯片对两组患者的外周血炎症细胞进行全基因组启动子甲基化分析。通过minfi和SeSAMe两种流程处理原始数据，筛选出在两个流程中均具有显著差异（名义P<0.05）且效应量（绝对Δβ >0.10）位于启动子近端（TSS200/TSS1500）的CpG位点作为候选差异甲基化位点。随后，对筛选出的候选基因进行焦磷酸测序验证，并最终在766名患者的大队列中，结合传统心血管风险因素和血液检测指标，通过分层逻辑回归分析和深度学习模型，验证CDH7启动子甲基化对预测SVD影像特征的独立贡献。此外，还通过多项逻辑回归亚组分析评估CDH7甲基化是否能独立预测WMH或腔隙。
3. 结果
3.1 与SVD影像特征相关的基因特异性启动子甲基化变化的分析与鉴定
在EWAS阶段，通过MethylationEPIC v2芯片分析了16名无SVD患者和16名全SVD患者的全血DNA甲基化谱。尽管经过细胞组成和混杂因素校正后，没有CpG位点达到错误发现率（FDR）<0.05的显著性阈值，但基于名义P值<0.05、效应量|Δβ| > 0.10以及启动子近端（TSS200/TSS1500）的筛选标准，鉴定出19个CpG位点，对应17个基因，包括CDH7、ZNF234、OR51A4、DEFB126、MAP3K8、TMCO6、TMEM191B、MMUT、TEX26、ZNF600、FAM240C、S100A13、S100A14、FLG2、MIR3667HG、RECK和MIR662。其中，CDH7和ZNF234在全SVD组中显示出启动子区一致的高甲基化（Δβ约为0.12），被优先用于下游验证。焦磷酸测序验证显示，CDH7的启动子甲基化水平>20%，而ZNF234的甲基化水平≤5%。因此，CDH7被最终选为潜在的基于血液的DNA甲基化生物标志物进行后续验证。
3.2 CDH7低甲基化作为预测SVD影像特征的独立变量的验证
在验证队列的766名患者中，53名患者（6.9%）在MRI上未显示任何SVD影像特征，而713名患者（93.1%）至少有一种影像特征。在比较外周炎症细胞类型时，发现单核细胞中的CDH7启动子甲基化水平显著低于T细胞或B细胞。在8种人类癌细胞系中进行的相关性分析显示，CDH7启动子甲基化水平与基因表达（以ΔCt值表示，CDH7归一化至ACTB）呈正相关，表明随着启动子甲基化增加，CDH7表达降低。在比较有SVD和无SVD患者时，有SVD患者年龄更大，同型半胱氨酸水平更高，且CDH7甲基化水平更低。
分层逻辑回归分析显示，当将心血管风险因素和血液检测结果作为基线模型时，高龄和高同型半胱氨酸水平是预测存在任何SVD影像特征的独立变量，该模型的曲线下面积（AUC）为0.819。当将CDH7甲基化水平加入模型后，CDH7低甲基化与高龄和高同型半胱氨酸一起，成为预测任何SVD影像特征的附加独立变量，AUC提高至0.833。深度学习模型分析也证实，在结合心血管风险因素和血液检测指标预测任何SVD影像特征时，CDH7低甲基化是与高龄、高同型半胱氨酸和男性一起位列前四的重要变量，模型的综合AUC为0.783。
通过多项逻辑回归对特定SVD影像特征进行分析发现，对于腔隙亚组，CDH7低甲基化和高同型半胱氨酸是预测孤立性腔隙影像特征的独立变量。对于合并其他特征的腔隙，年龄也被纳入模型。相反，对于WMH亚组，CDH7低甲基化并未出现在预测孤立性WMH的模型中，但它是预测合并其他特征的WMH的独立变量。这些结果表明，CDH7低甲基化是预测孤立性腔隙影像特征而非孤立性WMH影像特征的独立标志物。由于仅有5名患者表现为孤立性脑微出血，未对该亚组进行分析。
4. 讨论
本研究鉴定并验证了CDH7启动子低甲基化是脑小血管病影像学特征的独立表观遗传标志物。特别是当结合高龄和高同型半胱氨酸这两种既定的血管风险因素时，这种关联更为明显。CDH7低甲基化与腔隙的关系强于与WMH的关系，表明它可能是一种表型特异性的表观遗传标志物，尤其适用于腔隙性病理。
由于直接获取脑组织样本不切实际，利用外周血细胞（主要是循环炎症细胞）作为探索系统性表观遗传机制的替代组织受到越来越多的关注。我们的发现表明，单核细胞中CDH7甲基化水平低于T或B细胞，这意味着细胞类型特异性的表观遗传变异可能是全血样本中观察到的整体低甲基化信号的部分原因。
CDH7属于钙粘蛋白超家族，在细胞间粘附和细胞内信号传导中发挥核心作用。钙粘蛋白相关通路对于内皮完整性和血脑屏障稳定性至关重要。尽管CDH7本身主要在与神经发育相关的研究中被探讨，但新兴的通路分析将其与Rho信号和细胞骨架调节联系起来，这些过程与血管重塑和内皮功能相关。结合先前关于内皮功能障碍、炎症和细胞外基质重塑在SVD进展中作用的报道，我们的发现表明，CDH7低甲基化可能通过影响血管稳定性的机制，促进小血管病理。
研究中发现的高同型半胱氨酸血症是SVD预测模型中的一个独立变量。已知同型半胱氨酸升高会增加S-腺苷同型半胱氨酸浓度，从而抑制甲基转移酶活性并导致整体DNA低甲基化。因此，我们的模型中同时鉴定出高同型半胱氨酸血症和CDH7低甲基化作为独立预测因子，提示在同型半胱氨酸代谢改变与SVD患者CDH7基因特异性甲基化变化之间可能存在生物学联系。
本研究存在一些局限性。首先，EPIC芯片仅检测了基因组CpG位点的一部分，更广泛的表观基因组方法（如全基因组亚硫酸氢盐测序）可能会发现更多与SVD相关的位点。其次，需要更大规模和纵向队列以及外部验证来确定CDH7低甲基化作为生物标志物的稳健性和时间动态。第三，虽然全血是实用的替代组织，但其表观遗传信号可能无法完全反映大脑特异性过程。最后，血液样本是在急性缺血性卒中后数天内收集的，急性全身反应可能影响了外周血DNA甲基化模式。
总之，本研究表明，CDH7启动子低甲基化与脑小血管病相关，可能与腔隙性病理存在特定的关联。这些发现强调了表观遗传改变在增进对脑SVD生物学理解方面的潜在相关性，同时强调了在考虑临床或生物标志物应用之前，需要进行进一步的机制、组织特异性和纵向研究。
