《Frontiers in Immunology》：The critical window for host defense: macrophage trogocytosis eliminates Echinococcus multilocularis at the early establishment stage
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本研究揭示了宿主抵抗多房棘球绦虫（E. multilocularis, E.m）感染的关键机制。研究发现，在感染早期，巨噬细胞通过补体（complement）依赖的胞啃作用（trogocytosis）与寄生虫发生直接接触，是清除寄生虫的决定性因素。该工作定义了宿主免疫防御的关键时间窗口，并为理解寄生虫免疫逃逸和开发新型免疫疗法提供了重要见解。
宿主免疫防御的关键窗口：巨噬细胞在早期清除多房棘球绦虫感染中的作用机制
引言
多房棘球绦虫（Echinococcus multilocularis, E.m）是引起泡型包虫病（AE）的高度致病性人兽共患寄生虫。在人体内，其幼虫阶段主要在肝脏中定植，并以类似肿瘤的方式浸润肝组织，导致进行性肝损伤、纤维化，若不及时治疗可引发致命并发症。尽管化疗和手术治疗取得进展，但寄生虫清除不完全和疾病复发仍是主要临床挑战。该寄生虫能否建立慢性感染，关键取决于其在感染早期定植阶段逃逸宿主免疫应答的能力，这决定了后续的疾病结局。肝脏免疫微环境，特别是驻留巨噬细胞（库普弗细胞）和募集的髓系细胞的活性，在此过程中起着决定性作用。然而，巨噬细胞如何特异性靶向并清除E.m的侵袭性幼虫阶段，其具体效应机制尚不完全清楚。胞啃作用（trogocytosis），即免疫细胞通过直接接触“啃食”靶细胞碎片的过程，最近被认为是抗寄生虫免疫的关键机制。但其是否是巨噬细胞介导E.m清除的主要方式，以及由哪些关键因素调控，此前尚未有研究。本研究旨在探讨感染早期巨噬细胞-寄生虫相互作用的时空动态，并确定巨噬细胞是否主要通过胞啃作用清除E.m。
材料与方法
本研究通过新疆医科大学第一附属医院伦理委员会批准。实验采用6-8周龄雌性C57BL/6J小鼠，通过门静脉注射荧光标记的E.m原头节（PSCs）建立感染模型。通过组织病理学（H&E和天狼星红染色）、免疫荧光（使用F4/80标记巨噬细胞）和体内荧光示踪（使用DiI染料标记PSCs）技术，在感染后不同时间点（1, 3, 5, 7, 10天）分析肝脏病理变化和免疫细胞动态。体外实验方面，从小鼠腹腔获取并分化为常驻腹腔巨噬细胞（RPMs），与PSCs以500:1的比例进行共培养，并设置不同血清条件（正常小鼠血清MS、热灭活小鼠血清HI-MS）以探究补体系统的作用。通过扫描电镜（SEM）观察巨噬细胞与寄生虫的直接接触形态，并利用3D共聚焦成像确认胞啃过程。此外，进行了补体拯救实验，在无血清培养基中添加重组补体蛋白C3和C5，以验证补体成分在激活巨噬细胞杀伤活性中的必要性。统计学分析使用GraphPad Prism软件进行。
结果
3.1 荧光标记实现PSCs的体内高效示踪
研究首先建立了小鼠感染模型，通过体外用DiI染料标记E.m原头节并经门静脉注射。体外标记显示染料主要定位于体被，清晰勾勒出虫体形态且不影响其活性。感染后24小时，肝脏冰冻切片荧光分析显示，大量DiI标记的PSCs分布在门静脉区域和其他血管区域，这与血行性肝脏入侵途径一致，证实DiI标记是研究寄生虫-宿主相互作用的有效新工具。
3.2 E.m感染早期定植阶段的肝脏病理学与宿主反应
组织病理学分析显示，感染后早期（1天）肝脏病灶周围即出现免疫细胞浸润，表明E.m感染迅速触发宿主免疫反应。值得注意的是，在1-3天，部分病灶内仍可观察到完整的PSCs。5天后，PSCs结构发生显著改变。在一些病灶中，免疫细胞浸润病灶，并观察到PSCs结构碎片化，提示免疫介导的损伤。同时，在另一些病灶中，PSCs发生蜕变，开始向囊泡结构转化，导致病灶扩大。此外，还存在不再含有可见原头节、但被炎症反应包围并形成肉芽肿样结构的病灶。天狼星红染色显示，病灶周围炎症细胞浸润区域内出现进行性纤维化，且纤维化区域随病灶生长而扩大。
3.3 体内示踪表明巨噬细胞参与E.m感染的早期清除**
免疫荧光染色结合体内示踪分析发现，巨噬细胞在E.m感染早期即浸润至病灶核心，与寄生虫建立直接接触以促进清除。有趣的是，通过对不同发展结局的病灶进行详细分析，研究识别出两种截然不同的病灶表型：清除抵抗的“进展性病灶”表现为囊泡结构形成，巨噬细胞位于寄生虫团块外周，未能成功浸润病灶内部；而“消退性病灶”则显示出显著更高的巨噬细胞密度，完全覆盖了原头节占据的区域，寄生虫结构被基本完全清除，这些病灶随后发展成肉芽肿直至完全修复。这些发现表明，巨噬细胞能否有效浸润至病灶核心，是宿主抵抗E.m感染的关键，而这种抵抗力取决于巨噬细胞与寄生虫建立直接接触的能力。
3.4 巨噬细胞-寄生虫直接接触对清除早期E.m感染和阻止病灶进展至关重要**
体外共培养实验显示，在含有正常小鼠血清（MS）的条件下，巨噬细胞能显著抑制PSCs的活力。濒死的PSCs被攻击性巨噬细胞包围，其体被周围形成大量空泡。而当使用热灭活小鼠血清（HI-MS，以耗尽功能性补体成分）时，巨噬细胞的细胞毒性显著降低。双荧光标记也证实，与HI-MS组相比，MS组中有更多DiI标记的巨噬细胞粘附在DiD标记的PSCs上。扫描电镜观察进一步显示，在MS和HI-MS共培养组中均观察到巨噬细胞牢固附着于寄生虫，但MS组的粘附巨噬细胞数量显著更高，且这些细胞显示出典型的吞噬细胞样形态。
3.5 补体依赖性胞啃作用介导巨噬细胞对PSCs的杀伤
为排除小鼠血清中其他成分的非特异性干扰，研究使用纯化的重组补体蛋白（C3和C5）进行了拯救实验。结果表明，单独添加C3或C5，以及同时添加两者的组，均能激活巨噬细胞对PSCs的杀伤活性。相应的毒性对照实验排除了补体直接介导杀伤的可能性。此外，研究证实PSCs的清除依赖于巨噬细胞和小鼠血清的共同存在。为探究巨噬细胞是否通过胞啃作用清除寄生虫，研究采用了3D共聚焦成像。成像结果证实，粘附在PSCs上的巨噬细胞吞噬了PSC的膜成分，这是胞啃作用的典型特征。综上，这些结果证明，巨噬细胞在感染早期通过胞啃作用清除E.m。而且，单纯的接触不足以介导巨噬细胞的杀伤，此过程需要小鼠血清中的特定补体成分，这凸显了体内微环境对于有效抗寄生虫免疫的必要性。
讨论
泡型包虫病（AE）是一种致死性人兽共患病。早期定植阶段是宿主免疫系统要么根除寄生虫、要么允许不可逆囊肿形成的关键窗口，决定了临床结局。本研究证明，由补体系统协调的巨噬细胞胞啃作用，是这一决定性阶段清除E.m感染的主导机制。最重要的是，巨噬细胞能否有效侵入病灶内部，直接决定了感染结局：在“消退性病灶”中实现寄生虫的完全清除，而在“进展性病灶”中则发生寄生虫向后绦期囊泡的蜕变。
巨噬细胞作为先天免疫的核心效应细胞，通过多种机制在抗寄生虫防御中发挥关键作用。另一方面，寄生虫也采用多种策略劫持巨噬细胞以实现免疫逃逸和长期生存。为可视化展示巨噬细胞在E.m感染早期如何清除寄生虫，本研究创新性地采用亲脂性染料DiI荧光标记PSCs，实现了清晰的体内示踪。结合巨噬细胞特异性荧光染色，揭示了巨噬细胞通过侵袭性直接接触清除PSCs。利用此示踪方法，研究识别出两种不同的病灶结局：“进展性病灶”与“消退性病灶”，并发现了消退性病灶中残留的寄生虫成分。研究提出，独立于传统指标（如病灶大小、囊肿重量）的病灶分型，可作为评估E.m感染结局的新型、可量化标准，为药物开发和机制研究提供科学依据。
胞啃作用是一种细胞间相互作用过程，其中一方细胞通过直接接触主动“啃食”并摄取另一方细胞的组分碎片，导致靶细胞损伤或死亡。与经典吞噬作用不同，胞啃作用涉及移除小部分细胞膜而非立即吞噬整个细胞，使其特别适合攻击那些无法被整体吞噬的大型多细胞病原体。本研究表明，巨噬细胞通过补体依赖性胞啃作用清除PSCs。通过双荧光标记和3D共聚焦成像，观察到巨噬细胞主动啃食寄生虫体被碎片，这一过程可被血清补体的热灭活所阻断，并能通过添加重组C3或C5蛋白得以恢复。将胞啃作用确定为对抗E.m的关键效应机制，为治疗干预开辟了新途径。
补体通路通过三重机制协调巨噬细胞的抗寄生虫防御：调理作用（C3b/C4b沉积，使能CR3介导的吞噬/胞啃作用）、炎症募集（C5a导向的趋化性）以及直接细胞溶解压力（MAC形成）。其中，CR3是巨噬细胞胞啃作用的主要调节因子，它与FcγR信号和Ca2+依赖性NFAT通路协同激活Syk/PI3K，驱动肌动蛋白重塑以形成吞噬突触，从而增强膜“啃食”能力。相反，寄生虫通过劫持钙调蛋白等补体调节因子或破坏C3b沉积来破坏此轴，从而削弱胞啃作用。本研究发现，在含有小鼠血清的共培养体系中，巨噬细胞对PSCs表现出最强的杀伤效果，且进行胞啃作用的巨噬细胞显示出特征性的吞噬细胞样形态。值得注意的是，热灭活血清成分（消耗补体因子）显著削弱了此杀伤效果。补体拯救实验进一步证明，此细胞毒性效应是由补体依赖性机制特异性介导的。共聚焦3D成像结果为该杀伤机制是胞啃作用提供了进一步证据。
结论
综上所述，本研究首次揭示巨噬细胞可通过胞啃作用参与早期清除E.m感染，而此阶段的有效清除是宿主成功防御E.m感染的关键时间窗口。深入探究这一过程，有望发现宿主免疫系统对抗E.m感染的关键机制，从而为打破AE患者晚期存在的免疫耐受现象、增强免疫学治疗效果提供新的重要突破口。
