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本文综述了细胞外基质(ECM)生化信号在调控心脏成纤维细胞向诱导心肌细胞(iCMs)直接重编程中的关键作用。研究发现，在由四种microRNA (miR-1, miR-133, miR-208, miR-499)组成的miRcombo介导下，模拟心脏微环境的生物基质(BM)和层粘连蛋白(LN)涂层，相比纤连蛋白(FN)和I型胶原(CI)，能更有效地通过抑制YAP信号和细胞增殖，促进心脏标志物(如cTnT+)的表达和结构成熟，显著提高重编程效率。这项研究强调了在体外复制心脏微环境信号对于提升心肌再生策略疗效的重要性。
1 引言
直接重编程能够在不经过多能状态的情况下，通过激活谱系特异性转录通路，将内源性成纤维细胞转分化为特定细胞。在心脏再生医学中，这为在心肌梗死后同时逆转纤维化和补充收缩细胞提供了有前景的策略。早期策略依赖于过表达心脏转录因子，如Gata4、Mef2c、Tbx5(GMT)或与Hand2联用(GHMT)。最近，一种基于microRNA的方法被建立，通过联合使用四种microRNA (miR-1, miR-133, miR-208, miR-499，统称miRcombo)，在成年人类心脏成纤维细胞(AHCFs)中诱导产生类似iCMs的细胞。然而，体外重编程效率和iCMs的成熟度仍然有限，这表明除了重编程因子之外，微环境线索在指导细胞命运转换中起着关键作用。细胞外基质(ECM)是心脏微环境的主要组成部分，其特性如蛋白质组成和基质硬度被细胞识别，并通过机械转导通路传递给细胞核。Hippo信号通路通过激酶级联反应调节细胞增殖、命运决定和细胞可塑性，该级联反应控制着转录共激活因子Yes相关蛋白(YAP)和具有PDZ结合基序的转录共激活因子(TAZ)的活性。YAP/TAZ还作为机械敏感的转录调节因子，其核质定位受ECM组成、基质硬度、细胞密度和细胞骨架张力等生物力学和微环境线索的影响。本研究旨在研究不同的ECM成分（层粘连蛋白、纤连蛋白和I型胶原）以及从AHCFs长期体外培养产生的心脏组织样生物基质(BM)如何影响成纤维细胞的重编程。使用基于阳离子脂质[2-(2,3-双十二烷氧基丙基)-羟乙基]溴化铵(DE)和辅助脂质二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)的脂质复合体(DE-DOPE)来递送miRcombo，以评估其对AHCFs重编程的影响。
2 材料与方法
成年人类心脏成纤维细胞(AHCFs)购自Lonza。通过培养AHCFs 21天，使其沉积ECM，然后使用0.25% Triton X-100和10 mM NH4OH进行去细胞化处理，得到可溶性的生物基质(BM)粉末。通过琼脂糖凝胶电泳、分光光度法、BCA蛋白测定、扫描电子显微镜(SEM)和免疫荧光对BM进行了表征，确认了DNA的有效去除、蛋白含量及层粘连蛋白、纤连蛋白和I型胶原的保留。将AHCFs接种在6孔板中，24小时后用包裹了miRcombo的DE-DOPE脂质复合体(DE-DOPE/miRcombo)进行瞬时转染。转染24小时后，将细胞消化并重新接种到预先涂覆了不同ECM蛋白（层粘连蛋白、纤连蛋白、I型胶原、BM）或无涂层(NC)的孔板中。在接种到涂层上后的第3、7、15天进行分析。通过免疫荧光检测Ki67、YAP、Mef2C、心脏肌钙蛋白T(cTnT)和α-肌节辅肌动蛋白(α-SAR)的表达，并通过ImageJ分析YAP的核质比。通过流式细胞术在第15天分析cTnT阳性细胞比例以评估重编程效率。在第3天和第15天，通过微滴式数字PCR(ddPCR)检测YAP1、TAZ、TEAD以及心脏标志物TNNT2、CACNA1C、ACTC1的基因表达。在YAP阻断实验中，细胞在重编程过程中用ROCK抑制剂Y-27623处理15天。所有实验均进行三次重复，数据以均值±标准误表示，使用ANOVA进行统计分析。
3 结果
3.1 生物基质的优化与表征
去细胞化过程有效去除了DNA，BM样本显示出由薄纤维组成的互连网络结构。免疫荧光证实去细胞化后的BM保留了层粘连蛋白、纤连蛋白和I型胶原蛋白，而无细胞核信号。
3.2 ECM蛋白涂层对miRcombo介导的AHCFs向iCMs直接重编程的影响
在接种7天后，免疫荧光显示所有条件下均有Mef2C的核表达，但在纤连蛋白涂层上Mef2C阳性细胞核百分比显著较低。在第15天，流式细胞术分析显示，生物基质(BM)涂层产生的cTnT+细胞比例最高（约20%），层粘连蛋白涂层约为15%，而纤连蛋白和I型胶原涂层则较低（约10%）。免疫荧光图像显示，在无涂层、层粘连蛋白和BM涂层上培养的细胞，其cTnT在细胞骨架区室中的分布更具功能性。ddPCR分析表明，BM涂层显著上调了心脏标志物TNNT2、ACTC1和CACNA1C的基因表达，而纤连蛋白涂层的表达水平最低。高倍免疫荧光图像进一步证实，在无涂层、层粘连蛋白和BM上培养的细胞表达了cTnT和α-SAR蛋白，而在纤连蛋白和I型胶原上培养的细胞信号非常低。
3.3 YAP信号在不同ECM蛋白涂层上调控成纤维细胞的直接重编程
接种3天后，增殖分析显示纤连蛋白和I型胶原涂层诱导了最高的Ki67阳性细胞比例，而层粘连蛋白诱导的增殖活性非常低。基因表达分析显示，在纤连蛋白涂层上，无论是转染negmiR还是miRcombo，YAP1的表达均显著较高，而层粘连蛋白涂层的表达水平最低。TAZ表达在不同涂层间无显著差异。TEAD在纤连蛋白涂层的negmiR转染细胞中表达最高。免疫荧光显示，在纤连蛋白和I型胶原涂层上培养的细胞，其YAP核信号更强，核内YAP阳性细胞百分比和YAP核质强度比均显著高于无涂层和层粘连蛋白涂层。BM涂层显示出中间值。使用ROCK抑制剂Y-27632抑制YAP信号后，在所有涂层条件下，处理15天的细胞均显示出清晰的cTnT和α-SAR表达，并且TNNT2的mRNA表达相较于未处理细胞显著上调。
4 讨论
本研究探讨了不同ECM蛋白涂层对DE-DOPE/miRcombo脂质复合体转染的AHCFs行为的影响。研究表明，体外制备的、富含层粘连蛋白的BM最能支持心脏重编程，其产生的cTnT+细胞比例最高，并显著上调了心脏结构基因。相反，纤连蛋白和I型胶原涂层则维持了更高的细胞增殖率和YAP核定位，这与促纤维化的微环境一致，不利于重编程。YAP信号是关键调节因子，其核转位与较低的重新编程效率相关，而通过ROCK抑制剂抑制YAP活性则可改善重编程结果。这些发现表明，ECM的生化线索通过调节YAP等机械敏感通路，在决定细胞是走向增殖还是转分化中扮演了关键角色。模拟天然心脏ECM组成的基质，特别是富含层粘连蛋白的基质，能为体外直接心脏重编程提供更有利的微环境。
5 结论
本研究表明，ECM蛋白组成通过调节细胞行为、细胞骨架组织和机械敏感信号通路，显著影响miRcombo介导的AHCFs直接重编程。在测试的基质中，层粘连蛋白和生物基质涂层为心脏标志物表达和结构成熟提供了最有利的微环境，而纤连蛋白和I型胶原则与较低的重编程效率和更强的增殖表型相关。重编程效率的差异可能与不同ECM条件下YAP信号和细胞增殖的独特模式有关。支持较高重编程效率的基质通常表现出YAP核定位减少和早期增殖活性降低。这些发现强调了ECM生化线索通过塑造粘附介导和机械转导反应，在直接心脏重编程中发挥指导作用。利用富含层粘连蛋白的基质定制培养基底组成，是提高体外重编程性能和表型成熟度的一种有前景的策略。
