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这篇研究通过整合多组单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，系统描绘了肝细胞癌（HCC）肿瘤微环境（TME）中内皮细胞（EC）的异质性图谱，并聚焦于静脉内皮细胞（VenEC）在肿瘤血管生成中的核心作用。研究发现，由VenEC富集基因构建的预后风险评分模型（VERS）能够有效预测HCC患者的不良预后，并揭示出关键基因MARCKS在体外和体内通过促进内皮细胞功能（增殖、迁移、侵袭）和血管生成，进而驱动HCC进展，为HCC的抗血管生成治疗提供了新的潜在靶点和分子机制见解。
单细胞转录组解析肝细胞癌肿瘤微环境与内皮细胞异质性
单细胞分析揭示肝细胞癌的细胞组成并表征内皮细胞亚群
为了深入解析肝细胞癌（HCC）的细胞景观，研究整合了来自GEO数据库的三个HCC肿瘤单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集（GSE151530、GSE125449和GSE149614）。在批次效应校正后，共有41,301个细胞被保留用于后续分析。通过UMAP降维识别出六种主要细胞群体：T细胞、B细胞、髓系细胞、内皮细胞、肿瘤细胞和成纤维细胞。研究者运用无监督聚类和标志基因注释，在单细胞分辨率下描绘了HCC微环境的细胞架构。肿瘤细胞通过高表达肝细胞来源的载脂蛋白（如APOA1、APOH、AMBP）来鉴定。免疫细胞则通过PTPRC（CD45）表达进行宽泛定义，并进一步细分为B细胞和浆细胞、T细胞及髓系细胞。间质区室包含成纤维细胞和内皮细胞，共同重建了HCC生态系统中的主要谱系。研究进一步利用基于inferCNV的拷贝数变异（CNV）分析验证了肿瘤细胞的注释。与T细胞相比，肿瘤细胞表现出广泛的染色体改变，支持了注释的肿瘤细胞群体的恶性本质。相反，T细胞显示出近乎二倍体的基因组图谱，CNV信号极少，证实了其非恶性起源。
考虑到血管生成在肿瘤进展中的关键作用，研究进一步聚焦于肿瘤相关内皮细胞，以描绘肿瘤血管微环境。内皮细胞被进一步聚类为淋巴管内皮细胞和血管内皮细胞。后者被进一步分层为四个亚群：动脉内皮细胞、毛细血管内皮细胞、尖端细胞和静脉内皮细胞。
肝细胞癌中肿瘤相关内皮细胞的分化轨迹分析
肿瘤血管生成涉及从已存在血管的芽生以形成新血管。为了研究HCC肿瘤内内皮细胞的发育轨迹，研究基于转录谱使用“monocle3”R包进行了拟时序分析。根据先前关于血管芽生的生物学知识，在Monocle3分析中，静脉内皮细胞被手动指定为根群体，推断出的轨迹由此分支为尖端细胞，并最终汇集于动脉内皮细胞。独立地，使用“Slingshot”R包以无监督方式（不预设根）进行了平行的拟时序分析，该分析得出了可比较的轨迹结构，静脉内皮细胞位于分化路径的起点，动脉内皮细胞代表终末状态。
为了进一步了解调控内皮细胞分化的程序，研究应用SCENIC来推断跨内皮细胞亚群的转录因子活性。值得注意的是，静脉内皮细胞表现出特定转录因子（如SRF、ETS1、SMAD5等）的激活，其中许多与血管生成有关。静脉内皮细胞的转录活性谱强调了其高血管生成潜力，并支持其作为新生血管形成中祖细胞的角色。相比之下，尖端细胞显示FOSB、JUN和KLF家族成员富集表达，而动脉内皮细胞则表现出与血管成熟和稳定相关的转录因子（如ELF1、KLF2、HES5）表达增加。
为了研究内皮细胞亚群的预后相关性，研究对TCGA数据集的HCC患者进行了Kaplan-Meier生存分析。根据每个内皮细胞亚群前30个标志基因的中位表达，将患者分为高表达组和低表达组。值得注意的是，静脉内皮细胞特征基因的高表达与较差的总生存期显著相关，而尖端细胞、动脉内皮细胞、毛细血管内皮细胞和淋巴管内皮细胞的基因特征与预后无显著相关性，表明这些亚型在决定HCC临床结局中的作用有限。
静脉内皮细胞来源的基因特征预测肝细胞癌患者的预后、免疫浸润和药物敏感性
为了评估来源于静脉内皮细胞的基因表达特征的预后相关性，研究在训练队列中使用静脉内皮细胞亚群中高表达的30个基因进行了LASSO Cox回归分析，并确定了五个与总生存期显著相关的基因：MARCKS、IGFBP4、IGFBP5、RAMP3和TFF3。
基于这五个基因的表达水平，构建了静脉内皮相关风险评分模型。根据训练队列、内部验证队列和外部验证队列中VERS值的中位数，将患者分为高风险组和低风险组。在所有队列中，高风险组患者与低风险组相比，预后显著更差。Kaplan-Meier生存分析表明，高风险患者的总生存期显著降低。通过受试者工作特征曲线分析进一步评估了VERS模型的预测性能。训练队列中1年、2年和3年总生存期的曲线下面积值分别为0.713、0.728和0.724，在内部验证队列和外部验证队列中也表现出稳健的预后能力。
考虑到肿瘤免疫微环境在塑造患者预后和治疗反应中的关键作用，研究接下来探索了VERS特征与免疫特征之间的关联。具体而言，研究调查了免疫细胞浸润的差异是否可能是观察到的低风险和高风险组之间不同临床结局的基础。单样本基因集富集分析显示，在高风险组中，包括活化的B细胞、CD8+T细胞、自然杀伤细胞等多种免疫效应细胞的浸润显著减少。此外，通过多种反卷积方法验证确认，低风险组特征为更富含免疫的微环境，而高风险组则表现出相对免疫荒漠的表型。这些发现表明，静脉内皮相关基因特征可能作为评估HCC患者免疫景观和预测临床结局的潜在生物标志物。
为了探索该模型在指导治疗策略中的临床应用，研究进一步评估了高风险组和低风险组之间的药物敏感性。高风险患者对多种治疗药物的预测IC50值显著更高，表明药物反应性降低。这些发现表明，VERS模型具有作为跨不同患者群体的预后工具的潜力，并可能为HCC的治疗敏感性提供见解。
MARCKS高表达与肝细胞癌患者不良预后显著相关
为了阐明VERS模型的生物学相关性，研究对鉴定出的五个预后基因进行了全面分析。来自TCGA和GTEx数据库的基因表达谱显示，只有MARCKS在肿瘤组织中相较于癌旁正常组织显著上调。相比之下，IGFBP4、IGFBP5、RAMP3和TFF3在肿瘤和非肿瘤组织之间的表达没有统计学上的显著差异。
Kaplan-Meier生存分析根据每个基因的表达水平将患者分为高表达组和低表达组。值得注意的是，只有MARCKS高表达的患者与低表达患者相比，总生存期显著更差，表明MARCKS可能是HCC不良预后的关键驱动因素。这些发现表明MARCKS基因有潜力被用作HCC的预后生物标志物。
内皮相关的MARCKS在体外促进肝细胞癌进展
由于VERS模型是基于五个基因的表达水平构建的，用于患者间的风险分层，MARCKS因其对风险评分的主导贡献、在肿瘤内皮细胞中的特异性上调及其与内皮细胞功能的相关性，被选为功能验证的生物学候选基因。为了研究内皮细胞MARCKS表达在HCC进展中的功能意义，研究使用表达MARCKS靶向shRNA的慢病毒构建了MARCKS敲低的人脐静脉内皮细胞。在蛋白水平上证实了MARCKS的有效敲低。功能实验表明，MARCKS沉默显著损害了人脐静脉内皮细胞的克隆形成、迁移和侵袭能力。
为了进一步评估内皮细胞MARCKS对肿瘤细胞行为的影响，用MARCKS沉默的人脐静脉内皮细胞的条件培养基共培养Huh7人肝癌细胞。值得注意的是，暴露于MARCKS缺失人脐静脉内皮细胞上清液的Huh7细胞表现出显著降低的克隆形成、迁移和侵袭能力。这些发现表明，内皮相关的MARCKS促进了HCC的促肿瘤发生过程。
内皮相关的MARCKS在体内促进肝细胞癌肿瘤生长
为了证实体外研究结果，研究建立了皮下HCC异种移植模型。将Huh7细胞与MARCKS敲低的人脐静脉内皮细胞共同注射，与共同注射对照人脐静脉内皮细胞相比，导致肿瘤生长显著减弱，而仅注射Huh7细胞的组肿瘤生长速率处于中间水平。
与肿瘤生长减弱一致，Ki-67染色显示，来自MARCKS敲低人脐静脉内皮细胞组的肿瘤增殖活性较低。为了研究MARCKS敲低对肿瘤血管系统的影响，研究对已建立的内皮标志物CD31进行了免疫组化。来自MARCKS敲低人脐静脉内皮细胞组的肿瘤显示CD31阳性微血管密度降低，表明血管生成减少。
总之，这些数据表明，内皮细胞MARCKS通过促进肿瘤细胞增殖和新生血管形成，在调节肿瘤微环境中发挥着关键作用，强调了其作为HCC治疗靶点的潜力。
