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本文通过计算模拟，系统地评估了16个经实验验证的恶性疟原虫（P. falciparum）CD8+T细胞表位在不同地理人群中的HLA（人类白细胞抗原）覆盖度。研究发现，将宿主HLA的广泛结合性与寄生虫表位的高度保守性相结合，是设计针对多变病原体、能为不同人群提供广泛保护的多表位疟疾疫苗的关键策略。
引言
疟疾，特别是由恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）引起的疟疾，仍然是全球健康，尤其是世界卫生组织非洲地区的重大挑战。疟疾的传播受到高效蚊媒、适宜气候和医疗资源有限等多重因素影响。尽管通过使用驱虫蚊帐、抗疟药物和病媒控制等措施进行了不懈努力，但疟疾，尤其是在资源有限地区，仍然对公共卫生构成重大威胁。开发一种高效疟疾疫苗是长期以来的优先事项，然而，恶性疟原虫复杂的生命周期及其逃避免疫系统的能力，使得疫苗研发充满挑战。当前的疫苗策略针对寄生虫生命周期的不同阶段，其中红细胞前期因其能在寄生虫进入导致临床症状的血液阶段之前阻断感染，具有重要的战略意义。
环子孢子蛋白（Circumsporozoite Protein, CSP）是在子孢子表面高度表达的重要抗原，是迄今最先进疟疾疫苗RTS,S/AS01和R21/Matrix-M的主要成分。此外，顶端膜抗原1（Apical Membrane Antigen 1, AMA1）和富含血小板反应蛋白的匿名蛋白（Thrombospondin-Related Anonymous Protein, TRAP）也被视为潜在疫苗靶点。然而，这些抗原的多态性使得针对单一抗原变体的抗体反应对其他变体效果有限。
针对疟疾的细胞免疫应答高度依赖于人类白细胞抗原（Human Leukocyte Antigen, HLA）分子呈递的寄生虫来源肽段以刺激T细胞。HLA分子具有高度多态性，其在不同人群中的分布差异显著。因此，了解潜在疫苗表位的人群HLA覆盖度，对于设计能够在具有广泛HLA多样性的人群中有效的疫苗至关重要。本研究旨在通过计算模拟预测算法，进一步探索从CSP、AMA1和TRAP抗原中鉴定出的16个实验证实CD8+T细胞表位，在不同全球人群中的HLA识别范围，以确定具有高HLA覆盖度的表位，并找出在人群中具有相似HLA覆盖模式的表位，为设计针对恶性疟原虫的多表位疫苗构建体提供依据。
研究方法
表位与HLA等位基因选择
本研究选取了16个经实验证实的、源自CSP、AMA1和TRAP蛋白的恶性疟原虫表位，这些表位在本团队之前的研究中被鉴定为具有广泛结合性。这些表位均基于表位预测或湿实验在文献中已知，并已在本团队前期工作中被实验证实。所有肽段都与特定的HLA等位基因组相关联，关联依据来自于加纳研究参与者的HLA分型数据以及HLA超型分类。
表位保守性分析
通过免疫表位数据库（IEDB）的“表位保守性分析”工具，评估了这16个短肽在16个高度多样化的恶性疟原虫实验室菌株中的保守性。该属性表示表位在不同菌株中的存在情况。
群体覆盖度预测
为确定在14个地理亚区、78个国家及全球范围内，基于HLA类型分布，预期对这些表位产生免疫应答的个体比例，研究使用了IEDB群体覆盖度工具。该工具基于不同人群中HLA等位基因频率分布预测T细胞表位的群体覆盖率。对于每个表位，从HLA数据库中选择了属于实验显示可结合该表位的HLA超型的所有可能HLA等位基因进行分析。将一个包含16个表位及其关联HLA等位基因的文本文件上传至IEDB服务器，选择感兴趣的人群，生成群体覆盖度数据。输出数据包括每个表位的人群覆盖率百分比，以及表位在任一人群中可结合的等位基因数量。
数据分析
从IEDB预测工具获得的结果以比例形式整理。使用R语言进行数据可视化，以评估选定人群中可能对特定表位产生应答的个体百分比。为了研究表位间群体覆盖度模式的相似性，计算了相关性矩阵并进行可视化。通过Spearman等级相关性和t近似分布检验计算相关系数，结果以聚类热图形式呈现，使用欧几里得距离和完全连锁法对行和列进行层次聚类，以分组具有相似覆盖模式的表位。
结果
表位保守性
对源自恶性疟原虫CSP、AMA1和TRAP抗原的表位在16个高度多样化实验室菌株中的保守性评估显示，保守水平在表位间存在差异。其中，CSPep1、CSPep2、CSPep4、CSPep6、CSPep9、CSPep10、CSPep11和TRAPep1在分析的所有菌株中表现出100%的保守性。观察到的最低保守性为55.56%，属于肽段CSPep3。
地理亚区和全球的群体覆盖度
本研究对16个实验证实的、源自恶性疟原虫CSP、AMA1和TRAP蛋白的表位进行了计算模拟分析。这些表位显示出HLA I类结合广泛性，并使用IEDB群体覆盖度预测工具分析了其HLA多样性覆盖。在全球范围内，CSP来源的表位CSPep5显示出最高的群体覆盖度（>85%），其次是TRAPep1（54.75%）和CSPep10（54.15%）。CSPep5表位在欧洲、亚洲和美洲人群中也显示出最高的人群覆盖率百分比。大多数表位，特别是在非非洲人群中，全球覆盖率低于25%。总体而言，所有表位均能被不同全球区域的HLA类型识别，但CSPep4除外，其在亚洲、欧洲和美洲人群中的覆盖率低于2%。
在非洲，CSPep5具有最高的覆盖率（89.42%–93.35%），其中西非最高（93.35%），中非最低（89.42%）。相比之下，CSPep4覆盖率极低（0%–5.21%）。CSPep13在中非、东非、北非和西非排名第二，在南非覆盖率为64.12%。TRAPep1在中非和西非排名第三，而CSPep11在东非和北非排名第三。在南非，CSPep13排名第三。
观察到的覆盖率主要由A01、A02、A24、B07、B27、B44和B58等HLA超型（具体等位基因见表1）驱动。此外，在全球和非洲地区排名前五的表位（CSPep10、CSPep5、CSPep13、CSPep11和TRAPep1）在16个高度多样化的恶性疟原虫菌株中显示出高保守性。
不同国家的群体覆盖度
对16个表位在IEDB数据库中拥有HLA数据的78个国家进行的HLA覆盖度分析显示，在国家层面的识别模式存在差异。CSPep5始终获得最高覆盖率，其次是CSPep13、TRAPep1和CSPep11，而CSPep4、CSPep1、CSPep2和CSPep8属于识别度最低的表位。在非洲，CSPep5在苏丹、乌干达、布基纳法索和津巴布韦的覆盖率分别达到89.39%、92.12%、77.02%和97.24%。CSPep5的最低覆盖率出现在威尔士（1.00%）和阿联酋（2.00%）。CSPep13在12个非洲国家显示出广泛的覆盖率。TRAPep1在南非、喀麦隆、佛得角、摩洛哥、塞内加尔、突尼斯、赞比亚和津巴布韦达到较高覆盖率。在国家层面，TRAPep1、AMA1ep1和AMA1ep2的覆盖率在大多数国家超过50%，但在中非共和国，TRAPep1的覆盖率仅为3.00%。值得注意的是，CSPep5在美国、加拿大、奥地利、欧洲大部分地区和阿根廷等疟疾低风险国家仍保持>50%的覆盖率，但在疟疾负担相对较高的中非共和国仅为27.02%。
基于HLA覆盖度的密切相关表位的相关性聚类
为识别在不同地理区域中具有相似HLA覆盖度且具有显著相关性的表位，进行了Spearman等级相关分析。发现了多个显著相关性，并识别出三个具有相似覆盖度的不同表位簇。簇一包含五个表位（CSPep1、CSPep3、CSPep4、CSPep6、CSPep8），其HLA覆盖度最低；簇二包含五个表位（CSPep2、CSPep5、CSPep11、CSPep13和TRAPep1），其HLA覆盖度最高；簇三包含四个表位（CSPep7、CSPep9、CSPep10和CSPep12），具有中等HLA覆盖度。
讨论
目前获得许可的疟疾疫苗RTS,S和R21靶向寄生虫的红细胞前期，减少进入血液阶段导致疾病临床症状的寄生虫数量。这是一种减轻疾病负担的重要策略，两种疫苗被描述为抗疾病疫苗。然而，这两种疫苗提供的保护主要由抗体介导，CD8+T细胞的参与非常有限。维持这些抗体反应需要强大的T细胞反应。此外，能够靶向肝细胞内寄生虫的疫苗是可取的，因为它也能在寄生虫到达有症状的血液阶段之前阻止其生长。全子孢子疫苗已证明能够通过诱导针对细胞内寄生虫的强大T细胞反应来实现这一目标。因此，识别这些T细胞反应的目标对于开发相对更简单、更具成本效益的表位疫苗至关重要，这种疫苗有潜力保护人类免受大多数恶性疟原虫变体的侵害。因此，开发针对恶性疟原虫的表位疫苗需要仔细考虑宿主HLA多样性和寄生虫表位多样性。
当多表位疫苗被合理设计时，它们可以提供广泛的免疫力，因为它们旨在同时激活B细胞和T细胞。此外，广泛的人群HLA覆盖度可以增强靶向恶性疟原虫多个阶段的能力，从而提高效力、延长保护时间并限制免疫逃逸。然而，寄生虫的抗原变异、复杂生命周期以及抗原免疫优势的潜力，可能限制恶性疟原虫多表位疫苗设计的成功。需要精心的工程化设计来克服这些潜在的挑战。
本研究通过计算模拟HLA识别分析，使用IEDB平台的工具评估了从三个恶性疟原虫抗原中实验鉴定的独特表位的全球和国家特异性HLA覆盖度，以确认它们与通用多表位疫苗的相关性。本研究揭示了所选疟疾表位的人群HLA覆盖度存在显著的地理差异，反映了HLA分子的多态性及其在人类群体中的差异性分布。我们的分析确定了三个具有特别有前景特征的表位：IQNSLSTEW（CSPep5）、LLACAGLAYK（TRAPep1）和STEWSPCSV（CSPep10），它们在地理亚区层面和非洲地区表现出优异的人群HLA覆盖度。在国家特异性层面，CSPep5、CSPep13、TRAPep1和CSPep11在所选表位中具有相对较高的HLA覆盖度。CSPep5持续的高覆盖率再次证实了其作为CD8+刺激表位纳入表位疫苗构建体的潜力，而TRAPep1、AMA1ep1、AMA1ep2在中非共和国、威尔士和阿联酋人群中覆盖率的增加以及CSPep5覆盖率的低下，则印证了HLA分子在不同人群中的多样性。CSPep5在苏丹、乌干达、布基纳法索和津巴布韦等高疟疾风险国家的高覆盖率，支持了将其纳入区域特异性多表位疫苗配方。然而，IEDB中缺乏尼日利亚和加纳等高风险国家的HLA数据，可能会限制将潜在表位纳入疫苗构建体的理由。这为这些高风险国家提供了投资于其人群HLA分型并将数据提供给IEDB等数据库的机会，以支持合理的表位疫苗设计。
本研究中分析的13个CSP表位均位于用于构建RTS,S和R21疫苗的CSP片段中，并且处于CSP的NANP重复区之外。其中，CSPep3、CSPep5、CSPep6、CSPe7、CSPep8、CSPep10、CSPep11、CSPep12和CSPep3完全保守，而CSPep1、CSPep2、CSPep4和CSPep9表位存在氨基酸变异。据报道，NANP重复区外的表位在接种RTS,S和R21疫苗后，在激活CD8+T细胞方面发挥作用。这些发现表明，本研究中鉴定的保守表位，连同来自TRAP和AMA1的选定表位，当被纳入多表位疫苗时，可能有助于产生针对恶性疟原虫的更强大、更持久的CD8+T细胞反应。由于结合了广泛的HLA识别和跨越多个恶性疟原虫变体的氨基酸保守性，这些表位可能是纳入通用多表位疫苗配方的首要候选者。然而，我们承认本研究评估的表位的保守性估计可能被高估，因为表位的保守性评估是较早前仅使用16个高度多样化的实验室变体进行的。
CSP来源的表位CSPep5表现出卓越的群体覆盖度（全球>85%，西非高达93.35%），这归因于其对包括A01、A02、A24、B07、B27、B44和B58在内的多个HLA超型的广泛结合亲和力。形成鲜明对比的是，CSPep4等表位显示出极低的覆盖率（非洲<5%，其他地方<2%），说明了有限的HLA结合谱如何显著限制免疫识别。我们HLA覆盖度分析中使用的大多数HLA等位基因都属于先前在参与者中鉴定的常见超型。
虽然高人群HLA覆盖度是疫苗候选物选择的关键标准，但表位在不同寄生虫菌株间的保守性是一个同等关键的因素。值得注意的是，某些具有中等人群覆盖度的表位，如CSPep13，尽管由一组有限的HLA等位基因呈递，却表现出完全保守性。尽管该表位相对于其他表位表现出有限的HLA结合广泛性，但其氨基酸保守性可以证明其在功能试验后纳入疫苗构建体的潜力，因为它们可能提供针对多样化恶性疟原虫菌株的广泛保护。因此，在多表位疫苗中战略性地结合高HLA覆盖度和表位保守性，可以代表通用疫苗构建的一种平衡方法，确保广泛的免疫识别，同时减轻寄生虫菌株特异性免疫逃逸的风险。这种组合将应对这种疫苗设计方法中的两个关键挑战：跨不同HLA背景的广泛人群覆盖率的需求，以及对抗循环寄生虫菌株中抗原变异的保护。值得注意的是，所有三个表位都源自CSP或TRAP——在红细胞前期表达的抗原，这表明它们在预防初始感染方面可能特别有效。
研究结果也强调了在疫苗开发策略中考虑非流行人群的重要性。尽管严重疟疾传播仍集中在撒哈拉以南非洲，但来自低流行或无流行地区（如欧洲和美洲）的个体在前往这些高风险地区时需要有效的疫苗接种。表位结合覆盖率在非洲和非非洲人群之间的显著差异，突显了包容性疫苗配方的必要性，该配方需考虑全球HLA多样性。例如，AMA1来源的表位AMA1ep2在西非、东非和中非显示出较高的覆盖率，但在其他地区覆盖率较低，这展示了在没有为疫苗设计精心定制表位选择的情况下实现普遍保护所固有的挑战。
虽然具有广泛HLA结合谱的表位如CSPep5代表了有前景的疫苗候选物，但具有更有限覆盖率的保守表位也不应被忽视，因为它们可能对抵御不断进化的寄生虫菌株的长期保护做出重要贡献。最终，识别具有这些独特特征（涉及HLA广泛结合性和跨越多样化寄生虫菌株的氨基酸保守性）的额外表位，对于设计普遍适用的疟疾疫苗至关重要。该策略将利用每个表位的优势，同时减轻其各自的局限性。基于此设计的疫苗的免疫原性评估目前正在动物模型中进行，未来有潜力进入人体试验。通过采取一种满足流行和非流行人群需求的全球包容性策略，这些下一代疟疾疫苗可以在实现针对恶性疟原虫感染的公平和持久保护方面取得实质性进展。此类方法的范围也可以扩大到寻找可能在多个疟原虫物种间保守的表位，以开发针对多种疟疾寄生虫物种的疫苗。
本研究的一个重要局限性是在保守性分析中仅使用了实验室适应株的序列。尽管这些实验室菌株被选择来代表目前已知的恶性疟原虫寄生虫最大程度的多样性，但扩展到包括田间分离株序列可能会增加数据的代表性。此外，IEDB数据库中缺乏大多数非洲国家的HLA序列数据，限制了我们研究结果的普遍性。这一点尤其重要，因为非洲的HLA多样性更大。尽管如此，所呈现的数据对未来针对疟疾的通用疫苗候选物的设计具有相关性。此外，该方法可适用于分析和识别其他因抗原多态性限制了有效疫苗设计进度的疾病的广泛覆盖表位。
