《Frontiers in Plant Science》：QTL identification for yield components using single segment substitution lines dissected by rice CSSL-Z799
利用水稻CSSL-Z799衍生的单片段置换系（SSSLs）解析产量构成因子的遗传基础
摘要
作为世界上最重要的谷物之一，水稻的持续增产是育种的核心目标。然而，产量构成因子是由众多微效基因控制的复杂数量性状。单片段置换系为基因鉴定和设计育种提供了理想平台。本研究报道了一个染色体片段置换系Z799，其在日本晴遗传背景中携带了来自恢复系R225的10个置换片段，平均长度为3.0 Mb。与日本晴相比，Z799表现出复杂的产量相关表型。通过日本晴/Z799的次级F2群体进行遗传作图，共鉴定出27个QTL。而基于一种更高效的SSSL策略（获得了S1-S5五个系），共检测到35个QTL。所有五个SSSL均通过不同的QTL（qGL1, qGL3, qGL12-1, qGL12-2, qGL12-3）显著增加了粒长，且未损害粒宽。机制上，对颖壳细胞的显微观察揭示了两种不同的途径：四个QTL（qGL1, qGL3, qGL12-1, qGL12-2）通过促进细胞分裂来增加粒长，而qGL12-3则通过刺激细胞扩张达到相同效果。该研究不仅鉴定了产量构成因子的关键QTL，还阐明了其潜在的细胞机制，为未来的基因克隆和设计育种策略提供了平台。
1 引言
水稻是世界最重要的粮食作物之一，提高产量仍是育种工作的核心目标。水稻产量主要由粒重、每穗粒数和有效穗数决定。解析调控水稻产量性状的数量性状位点（QTL）对实现高产设计育种至关重要。染色体片段置换系（CSSLs）能够实现QTL的精准鉴定，也是研究基因功能和设计育种的重要资源。当CSSL仅包含单个置换片段时，称为单片段置换系，代表了更高效的遗传和育种资源。目前已利用CSSL或近等基因系图位克隆并功能鉴定了多个产量相关QTL，如GW2、GS5、TGW2、GS3、GL7等基因。这些QTL的克隆为水稻高产分子设计育种奠定了坚实基础。尽管已克隆了一些产量相关QTL，仍有许多微效QTL未被发现。为了解析这些QTL，需要开发SSSL文库以消除背景干扰。本研究基于先前利用水稻染色体片段置换系Z255（在日本晴背景中携带18个置换片段）的研究，进一步利用CSSL-Z799（源自日本晴/Z255，包含10个置换片段）作为研究材料。我们进行了产量相关性状的QTL定位，并开发了次级单片段置换系。利用五个衍生的SSSL，分析了产量性状QTL的加性效应，并对携带粒形QTL的SSSL进行了籽粒细胞学检查。这项工作为未来相关基因的图位克隆奠定了基础，同时也为水稻分子设计育种提供了可靠的遗传信息和资源。
2 材料与方法
2.1 植物材料
水稻CSSL-Z799是通过从日本晴与Z255（一个在日本晴遗传背景中携带来自籼稻恢复系R225的18个置换片段的CSSL）杂交的后代（F2:5）中进行标记辅助选择（MAS）培育而成。所得CSSL包含10个置换片段。受体亲本日本晴是具有完整基因组测序的高品质粳稻品种。供体亲本R225是水稻研究所培育的优良籼稻恢复系。基于Z799的MAS衍生背景，本研究使用对应于10个置换片段的16个多态性分子标记和这些片段外的32个多态性SSR标记，利用10株Z799植株验证置换片段并评估遗传背景纯度。使用来自日本晴和Z799杂交的包含200个个体的次级F2群体进行初步QTL定位。基于表型评估和初步QTL结果，随后在次年开发了次级片段置换系。
2.2 植物材料和栽培
2.2.1 杂交阶段（2021年）
2021年7月，在西南大学歇马实验基地进行受体亲本日本晴与Z799的杂交以产生杂交种子。同年9月，这些F1杂交种子种植在海南基地以产生F2群体种子。
2.2.2 田间试验（2022-2024年）
2022周期：3月10日播种亲本系（日本晴、R225、Z799）和F2群体种子。4月18日，每亲本系30株幼苗和200株F2植株以行距16.5厘米、株距26.4厘米移栽，每行10株。2023周期：3月10日播种亲本系和五个F2衍生的SSSL候选系种子。4月18日，每系30株以相同间距移栽。2024周期：3月12日播种亲本系和已开发的五个SSSL（S1-S5）种子。4月20日，每系30株以相同间距移栽。所有试验均按照重庆地区标准农艺实践进行管理，以确保代际间实验一致性。
2.3 产量相关性状评估
在完全成熟时，分别从日本晴、Z799和SSSL（S1-S5）的小区中随机抽取10个单株，并从F2群体中抽取200个单株。对亲本系、F2群体调查了十四项产量相关性状。测量株高、穗数、穗长、一次枝梗数、二次枝梗数、每穗小穗数、每穗粒数、单株产量。用20厘米直尺测量10粒谷物的总长度和宽度，重复三次，然后计算每株的单粒平均值。长宽比计算为粒长除以粒宽。日本晴和Z799的千粒重从3000粒的随机样品中测量，从中称量1000粒子集，重复三次。每个F2植株的千粒重测定为200粒的重量乘以5，重复三次。结实率计算为每穗粒数占每穗小穗数的百分比。着粒密度确定为每10厘米穗长的小穗数。使用Microsoft Excel 2016计算每个性状的平均值、标准差和相关统计分析。
2.4 QTL定位
移栽后四周，从单个F2植株、Z799、日本晴和次级片段置换系收集叶片样品。通过CTAB法提取基因组DNA并用作PCR扩增模板。使用对应于Z799中10个置换片段的16个多态性SSR标记作为引物。在12.5 μL反应混合物中进行PCR。PCR产物通过10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离，并通过快速银染显色。基于200个个体的表型数据，使用SAS 9.3中的混合线性模型（MLM）进行QTL分析。应用P < 0.05的显著性阈值来宣告数量性状位点（QTL）的存在。
2.5 单片段置换系的开发
基于QTL定位结果，从F2群体中使用标记辅助选择（MAS）选择了五个仅携带单个纯合置换片段和0-1个杂合标记的F3植株。然后将这些植株作为独立品系种植。从每个品系中，采集20株植物的叶片用于DNA提取，并使用置换片段和杂合标记的标记进行基因分型。
2.6 单片段置换系中的QTL鉴定和加性效应分析
由于每个SSSL仅在单个染色体片段上与日本晴不同，表型差异可归因于独特的置换片段。遗传模型定义如下：对于日本晴，P0= μ0+ ?（其中μ0是均值，?是误差）；对于SSSL，Pi = μ0+ ai+ ?（其中ai是加性效应）。因此，使用t检验鉴定每个SSSL中产量性状的QTL：无效假设（H0）表明在SSSLi的置换片段中不存在控制该性状的QTL，而备择假设（H1）表明存在QTL。当P < 0.05时，接受H1，表明在SSSLi中存在特定性状的QTL。加性效应ai估计为pi和p0差值的一半。
2.7 使用扫描电子显微镜对SSSL和日本晴的颖壳进行细胞学分析
在孕穗期结束和抽穗前，从每个SSSL和日本晴的每株植物主穗中部取3粒谷粒。使用配备冷冻台（-40°C）的Hitachi SU3500扫描电子显微镜，在低真空条件下检查日本晴和五个SSSL（S1–S5）颖壳的内外表皮细胞。
3 结果与分析
3.1 Z799中染色体置换片段的鉴定
对10株Z799植株的置换片段和遗传背景纯度分析证实了所有10个目标片段的准确性，并且不存在来自供体系R225的残留片段。Z799中的10个置换片段位于第1、3、4、7、8、9、10和12号染色体上，总长度为30 Mb。单个片段长度从0.8 Mb到7.7 Mb不等，平均为3.0 Mb。
3.2 Z799和日本晴的产量相关性状分析
与日本晴相比，Z799的株高（73.71厘米）显著降低了16.34%（日本晴：88.11厘米）。Z799的穗长（18.00厘米）比日本晴（19.07厘米）短5.61%。相比之下，Z799的粒长（8.72毫米）和粒宽（3.45毫米）相对于日本晴（7.46毫米和3.43毫米）分别显著增加了16.89%和0.58%。Z799的二次枝梗数（11.00）与日本晴（14.54）相比显著减少了24.35%；而Z799的结实率（91.76%）相对于日本晴（81.66%）显著增加了12.37%。相反，Z799的一次枝梗数（13.88）和长宽比（2.37）显著高于日本晴（分别为9.23和2.17），分别增加了50.38%和9.22%。此外，Z799的千粒重（24.41克）比日本晴（23.18克）高5.30%。
3.3 对Z799携带的置换片段进行产量相关性状的QTL定位
利用日本晴/Z799衍生的次级F2群体，鉴定出27个控制产量相关性状的QTL。这些QTL分布在5条染色体上：1、3、7、9和12。它们包括3个株高（PH）、2个穗长（PL）、4个一次枝梗数（NPB）、4个二次枝梗数（NSB）、2个每穗小穗数（SPP）、2个每穗粒数（GPP）、3个着粒密度（SSD）、4个粒长（GL）、2个长宽比（RLW）和1个千粒重（GWT）QTL。这些QTL的表型变异解释率（PVE）从2.23%到17.45%不等，其中6个QTL（qPL1, qNPB1, qNPB7, qPH1-2, qSPP1, qSSD1-1）各自超过10%。在第1染色体上，七个QTL（qPH1-1, qPL1, qNPB1, qNSB1-1, qSPP1, qGPP1-1, qSSD1-1, qGL1-1）与标记RM8111紧密连锁。来自恢复系R225的加性效应如下：qPH1-1增加株高0.51厘米，qNPB1-1增加一次枝梗数0.43，qPL1增加穗长1.59厘米，qNSB1-1增加二次枝梗数1.64，qSPP1增加每穗总粒数10.70，qGPP1-1增加每穗饱粒数5.88，qGL1-1增加粒长0.05毫米。另外六个QTL（qPH1-2, qNSB1-2, qGPP1-2, qSSD1-2, qGL1-2, qGWT1）与标记RM1268紧密连锁。来自R225的加性效应为：qPH1-2降低株高2.96厘米，qNSB1-2降低二次枝梗数1.37，qGPP1-2降低每穗粒数4.63，qSSD1-2降低每10厘米穗长粒数1.96，qGL1-2增加粒长0.10毫米，qGWT1增加千粒重0.39克。在第3染色体上，qGL3和qRLW3与标记RM5928紧密连锁。来自R225的加性效应为：qGL3增加粒长0.05毫米，qRLW3增加长宽比0.02。在第7染色体上，四个QTL（qNPB7, qPH7, qSPP7, qSSD7）与标记RM172紧密连锁。来自R225的加性效应为：qNPB7增加一次枝梗数0.36，qPH7增加株高1.60厘米，qSPP7增加每穗小穗数5.34，qSSD7增加每10厘米穗长粒数2.02。在第12染色体上，四个QTL（qPL12, qNSB12-1, qGL12, qRLW12）与标记RM27819紧密连锁。来自R225的加性效应为：qPL12降低株高0.47厘米，qNSB12-1降低二次枝梗数1.19，qGL12增加粒长0.06毫米，qRLW12增加长宽比0.02。此外，两个QTL（qNPB12, qNSB12-2）与第二个置换片段标记RM519连锁，来自R225的加性效应分别为增加一次枝梗数0.31和增加二次枝梗数1.71。此外，我们还发现一些QTL总是成簇检测到。这些相关性模式表明某些QTL簇存在多效性效应。具体而言，qPL1, qNPB1, qNSB1-1, qSPP1, qGPP1-1, qSSD1-1似乎代表一个多效性区域，而qGL1和qPH1-1应仅与该组松散关联。类似地，qNPB7, qPH7, qSPP7, qSSD7可能共享多效性效应。此外，qPL12和qNSB12-1似乎是多效性的，而qGL12应仅为弱连锁。
3.4 从Z799开发单片段置换系
基于QTL定位结果，进一步开发了五个单片段置换系（S1–S5）。其中，S1和S2分别在第1和第3染色体上携带置换片段，而S3、S4和S5均在第12染色体上携带置换片段。详细的置换信息如图3所示。
3.5 在开发的SSSL（S1-S5）中进行产量性状的加性效应分析和QTL检测
在单片段置换系S1–S5中总共鉴定出35个产量相关性状QTL，其中包括5个粒长、3个每穗小穗数、3个每穗粒数、5个长宽比、3个千粒重、4个一次枝梗数、3个二次枝梗数、3个着粒密度、2个单株产量、2个株高和2个穗长QTL。其中，15个QTL（qPL1, qNPB1, qNPB12-2, qPH1, qNSB1, qNSB12, qSPP1, qGPP1, qSDD1, qGL1, qGL12-1, qGL3, qRLW3, qRLW12-1, qGWT1）也在前述F2群体中检测到，表明其具有跨年份的稳定遗传性。其余18个QTL（qGL12-2, qSPP3, qSPP12, qGPP3, qGPP12, qRLW1, qRLW12-2, qGWT3, qGWT12, qNPB3, qNPB12-1, qNSB3, qSDD3, qSDD12, qYD3, qYD12, qPH12, qPL12）仅在SSSL中检测到，证明了SSSL相比F2群体具有更高的QTL检测效率。携带QTL的SSSL S1–S5（qGL1, qGL3, qGL12-1, qGL12-2, qGL12-3，加性效应分别为0.22, 0.27, 0.17, 0.24和0.35毫米）的粒长（7.77, 7.86, 7.66, 7.80, 8.01毫米）显著大于日本晴（7.33毫米）。相比之下，这些SSSL的粒宽（3.58, 3.53, 3.54, 3.52, 3.56毫米）与日本晴（3.54毫米）无差异。S1–S5（携带qRLW1, qRLW3, qRLW12-1, qRLW12-2, qRLW12-3，加性效应分别为0.05, 0.09, 0.05, 0.08, 0.09）的长宽比显著高于日本晴（分别为2.17, 2.25, 2.16, 2.22, 2.25对比2.07）。S1（携带qGWT1, a=1.27克；26.00克）和S2（携带qGWT3, a=0.11克；24.85克）的千粒重相对于日本晴（23.46克）显著增加，而缺乏千粒重QTL的S3–S5（22.77, 23.00, 23.00克）无显著差异。对于一次枝梗数，S1（qNPB1, a=0.90）、S3（qNPB12-1, a=0.65）和S4（qNPB12-2, a=1.40）的枝梗数（12.00, 11.50, 13.00）显著多于日本晴（10.21），而S2（qNPB3, a=-0.34）显著更少（9.52），S5（无QTL）无差异（9.81）。二次枝梗数在S1（qNSB1, a=2.67）、S2（qNSB3, a=3.80）、S4（qNSB12-1, a=4.51）和S5（qNSB12-2, a=1.45）中显著高于日本晴（21.00, 23.25, 24.76, 18.55对比15.65），S3（14.68）未观察到差异。每穗小穗数在S1（qSPP1, a=22.06）、S2（qSPP3, a=9.78）、S4（qSPP12-1, a=11.22）和S5（qSPP12-2, a=26.33）中相对于日本晴（101.88）显著增加（146.00, 121.00, 124.31, 154.55），而S3（121.00）无显著差异。同样，每穗粒数在S1（qGPP1, a=20.20）、S2（qGPP3, a=8.65）、S4（qGPP12-1, a=13.54）和S5（qGPP12-2, a=27.19）中显著多于日本晴（101.88）（133.33, 110.24, 96.56, 154.55），S3（121.00）无显著差异。每10厘米穗长的小穗密度在S1（qSSD1, a=9.64）、S2（qSSD3, a=5.68）、S4（qSSD12-1, a=6.66）和S5（qSSD12-2, a=12.16）中也显著高于日本晴（49.94）（69.23, 61.31, 63.26, 74.27），而S3（51.29）无差异。单株产量在S2（qYD3, a=5.04克；28.90克）和S4（qYD12, a=4.24克；27.30克）中显著高于日本晴（18.82克），而缺乏产量QTL的S1、S3
