《Frontiers in Microbiology》：Temporal heterogeneity of microbial ecosystems and its formation mechanisms in Moutai-flavor Baijiu fermentation
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本文通过多组学（16S/ITS）测序与理化（CO2-TPD/XRF）分析，系统揭示了茅台风味白酒车间龄期（5-30年）差异驱动窖池发酵醅微生物群落（尤其是核心差异菌属乳杆菌Lactobacillus）结构变化的深层机制。研究发现，作为主要微生物源（平均贡献54.2%）的冷却场，其表面总碱度经30年生产降低了3.6倍，从初始碱性环境（高丰度Alkalibacterium, Nesterenkonia）逐步驯化为利于酸性环境微生物（如Lactobacillus）富集的微生态位，为新车间的精准驯化提供了关键理论依据。
车间龄期对窖池发酵醅微生物群落结构的影响
茅台风味白酒的窖池发酵醅是经蒸煮、冷却、加曲、堆积发酵后满足入窖标准的产物，其微生物多样性是环境与酒曲微生物被发酵醅截留、筛选和富集的综合体现。通过对5、10、20和30年不同龄期车间样品的分析，发现发酵醅中细菌以厚壁菌门（Firmicutes, 87.87%）为主，而拟杆菌门（Bacteroidetes）的相对丰度随车间龄期增加呈下降趋势（从5年车间的10.54%降至30年车间的2.26%），这可能与酿造环境的pH值差异有关。真菌群落则以子囊菌门（Ascomycota, 88.55%）为主导，未检测到与龄期相关的梯度差异。
在属水平上，发酵醅中的优势细菌属包括克氏杆菌（Kroppenstedtia）、乳杆菌（Lactobacillus）和芽孢杆菌（Bacillus）。其中，乳杆菌是区分不同龄期车间的核心差异菌属，其平均相对丰度（ARA）从5年车间的15.02%显著增加至30年车间的35.59%。优势真菌属则包括伊萨酵母（Issatchenkia）、接合酵母（Zygosaccharomyces）和毕赤酵母（Pichia）。
细菌α多样性（Shannon, Chao1指数）随车间龄期增加呈数值下降趋势，30年车间的群落多样性最低，表明老旧车间经过长期驯化，核心功能微生物占据主导并抑制了杂菌生长，群落结构更稳定。细菌β多样性分析显示，30年车间的样品聚类更集中，而5年和10年车间的样品分散度较高，表明新车间的微生物群落更易受外源微生物定植影响，组成波动性更大。相比之下，真菌群落的α和β多样性在不同龄期车间间均无显著差异，表现出更高的稳定性。
不同龄期车间生产中的时间异质性微生物
进一步分析显示，多个细菌属的丰度变化与车间龄期显著相关。醋酸杆菌（Acetobacter）和乳杆菌（Lactobacillus）的ARA随车间龄期增加呈上升趋势，其中30年车间乳杆菌的ARA（45.75%）极显著高于5年车间。这两种菌均具有嗜酸和产酸特性。相反，厌氧盐杆菌（Anaerosalibacter）、弓形杆菌（Arcicella）、芽孢杆菌、克氏杆菌、枝芽孢杆菌（Virgibacillus）和海洋芽孢杆菌（Oceanobacillus）的ARA则随车间龄期增加呈下降趋势，这些微生物多具有嗜盐、耐热特性，更适应中性至碱性环境。
真菌群落整体稳定，仅酿酒酵母（Saccharomyces）和接合酵母（Zygosaccharomyces）的ARA在30年车间显著高于5年车间，它们与乳杆菌类似，适应微酸性环境。线性判别分析（LEfSe）进一步确认，乳杆菌是30年车间最核心的生物标志物。5年车间的特征生物标志物则为涅斯捷连科氏菌（Nesterenkonia）和土壤杆菌（Arachidicoccus），二者均为嗜碱或耐碱的稀有微生物属。这些结果表明，随着车间龄期增加，酿造系统内部微环境发生定向酸化，导致嗜酸类群富集，而新车间的碱性或中性环境则利于嗜碱或耐碱类群形成独特的富集模式。
窖池发酵醅中乳杆菌的来源追溯分析
窖池发酵醅的微生物群落主要来源于大曲和环境（冷却场、空气等）。本研究比较了大曲、空气和冷却场中微生物组成的差异。大曲中的优势细菌为芽孢杆菌、克氏杆菌和斯考利杆菌（Scopulibacillus），真菌优势属为曲霉（Aspergillus）、嗜热丝孢菌（Thermomyces）和根霉（Rhizopus）。车间空气中的优势微生物组成与大曲高度相似，推测是曲粉对空气微生物产生了环境驯化作用。两者中乳杆菌的ARA均处于较低水平（约2%），且无显著龄期差异，表明它们可能不是驱动发酵醅中乳杆菌丰度差异的主要来源。
冷却场微生物组成分析
冷却场表面共检测到639个细菌属，优势菌为乳杆菌、芽孢杆菌和克氏杆菌。真菌优势属为伊萨酵母、曲霉和嗜热丝孢菌。其中，乳杆菌的ARA随车间龄期增加呈现明确的上升趋势（从5年车间的15.02%增至30年车间的35.59%），这与发酵醅中的变化趋势一致。相比之下，海洋芽孢杆菌的ARA则随龄期增加而下降。这表明，经过长期堆积发酵驯化的老旧车间冷却场，其表面理化性质和微生物群落结构发生了显著变化。
基于SourceTracker的乳杆菌溯源分析
为量化不同来源对发酵醅细菌群落的贡献，研究采用了SourceTracker进行微生物源解析。结果显示，冷却场是发酵醅细菌群落最主要的贡献者，平均贡献率达54.2%，最高可达96%；其次是大曲（平均22.6%）和空气（平均15.7%）。此外，冷却场与发酵醅的群落相似性最高（74.6%），远高于大曲（62.7%）和空气（73.8%）。这些结果证实，冷却场是驱动不同龄期车间发酵醅中乳杆菌丰度差异的关键可追溯来源。30年车间冷却场初始较高的乳杆菌丰度，在后续堆积发酵过程中被进一步放大，最终导致其发酵醅中乳杆菌丰度显著高于5年车间。
冷却场理化性质与其微生物群落的相互作用
冷却场由传统三合土（TLCS，由生石灰、紫红泥和煤渣混合制成）构建。X射线荧光光谱（XRF）分析显示，其主量元素为O、Si、Ca、Al、S、Fe和Mg。二氧化碳程序升温脱附（CO2-TPD）分析表明，TLCS及其组分（生石灰、紫红泥、煤渣）均具有强碱性位点，碱性强度顺序为：煤渣 < 三合土 < 紫红泥 < 生石灰。生石灰中丰富的Ca2+为碱性位点提供了额外活性位点，使得新建TLCS冷却场表面总碱度较高。
比较新建与使用30年的TLCS冷却场发现，经30年生产后，冷却场表面总碱含量从0.11 mmol·g?1大幅降至0.03 mmol·g?1，降幅达3.6倍。元素分析显示，这一变化与材料中Ca含量显著下降直接相关，而Si/Al比保持稳定，表明材料骨架结构未变，Ca2+的流失是导致表面碱性下降的关键。这归因于长期生产操作中，酸性物料（如发酵醅、尾酒）与碱性表面发生酸碱中和。氮气吸附-脱附分析进一步揭示，长期使用使冷却场表面形成了介孔/大孔结构，增加了粗糙度和孔隙率，为微生物定植提供了更有利的物理栖息地。
新旧冷却场表面微生物群落差异
微生物群落分析显示，新建TLCS冷却场表面富集了大量嗜碱细菌，如嗜碱杆菌（Alkalibacterium, 16.18%）和涅斯捷连科氏菌（Nesterenkonia, 11.46%），后者正是5年车间发酵醅的关键生物标志物。嗜碱杆菌是专性嗜碱菌，无法在低pH环境下生长。相比之下，新建冷却场中乳杆菌的ARA极低（2.17%），而30年老冷却场则高达35.59%。真菌群落结构在新旧冷却场间差异较小，再次印证了真菌对环境胁迫的高抗性和耐受性。这表明，新建冷却场的强碱性表面环境是抑制嗜酸乳杆菌生长、导致新车问发酵醅中其丰度偏低的关键因素。碱性环境会导致跨膜pH梯度逆转，破坏质子动力，从而抑制乳杆菌的关键代谢活动。
结论
本研究通过多组学与理化分析相结合，系统阐明了茅台风味白酒不同龄期车间微生态差异的形成机制。乳杆菌是区分车间龄期的关键生物标志物，其丰度随车间使用年限增加而显著升高。冷却场被确认为发酵醅微生物群落（尤其是乳杆菌）最主要的来源和驱动者。其根本机制在于，新建冷却场表面的高总碱度环境利于嗜碱菌富集并抑制嗜酸菌；随着长期生产使用，酸性物料的持续作用使表面碱度大幅降低，微环境逐步酸化，从而定向驯化并富集了以乳杆菌为核心的功能微生物群落。这一发现揭示了长期生产实践对酿造微生态的驯化过程，为新车间的快速微生态适应与基酒品质提升提供了重要的理论依据。
