治疗性乙肝疫苗DNA初免-MVA加强策略：需联合重组HBsAg增强中和抗体应答

这篇综述探讨了一种创新的治疗性乙肝疫苗TherVacB，其采用异源初免-加强策略。研究核心在于评估DNA疫苗替代重组蛋白用于初免的潜力，并揭示了DNA初免虽能有效诱导抗病毒CD8+T细胞反应，但难以产生足够的中和性抗HBs抗体。文章通过在小鼠模型中的系统实验证明，将DNA与佐剂化重组HBsAg序贯（而非同时）联用，可协同激发强大的体液与细胞免疫，为开发能实现功能性治愈的慢性乙肝疗法提供了关键见解。

　　

引言

慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球重大健康负担，尽管已有安全有效的预防性疫苗超过40年，但现有抗病毒疗法很少能实现治愈。慢性HBV携带者会形成HBV特异性免疫耐受，其特征是缺乏抗HBs抗体以及微弱的病毒特异性CD4⁺和CD8⁺T细胞反应。因此，能够重新激活慢性感染者体内HBV特异性免疫、从而清除被感染肝细胞的治疗性疫苗，是治愈慢性乙肝（CHB）的有希望策略。

本研究团队开发了临床候选治疗性乙肝疫苗TherVacB，它采用异源初免-加强方案。该方案使用佐剂化的重组表面抗原（HBsAg）和核心抗原（HBcoreAg，可形成病毒样颗粒）进行初免，然后使用表达多种HBV抗原的改良痘苗病毒安卡拉载体（MVA-HBVac）进行加强。临床前小鼠模型已证明，TherVacB可同时激发强大的抗HBs、CD4⁺和CD8⁺T细胞反应。为了促进临床转化并拓宽疫苗免疫反应，研究者构建了新型MVA-HBVac载体，表达优化的HBV Core、小和大包膜蛋白（S和L）以及聚合酶逆转录酶域[RT(pol)]的序列，可覆盖全球>95%的流行HBV毒株。

由于成功的TherVacB疫苗接种在很大程度上依赖于优化的初免，研究者认为，包含更全面的HBV抗原（特别是MVA-HBVac中包含而蛋白初免未覆盖的HBV聚合酶和大包膜蛋白pre-S结构域）的初免免疫，可能会进一步增强疫苗的免疫原性。然而，重组蛋白疫苗需要为每种抗原优化复杂的生产纯化工艺，成本高昂，且需要特定的佐剂才能引发强效的效应CD8⁺T细胞反应。作为一种替代方案，DNA疫苗能在体内内源性表达目标抗原，代表了一种经济高效、易于扩大生产的疫苗平台。尽管DNA疫苗在临床试验中免疫原性有限，但当用于异源初免-加强方案的初免，随后用编码相同抗原的病毒载体加强时，其效力已显示出改善。本研究旨在探讨一种泛基因型的DNA疫苗（DNA-HBVac）能否成功替代单一基因型的佐剂化重组蛋白用于TherVacB的初免，并在与新型MVA-HBVac载体联合加强时提高疫苗效力。

DNA-HBVac疫苗的构建与验证

研究者构建了DNA-HBVac质粒，其表达盒在CMV启动子控制下，编码五个HBV蛋白：小包膜蛋白S（adw亚型，基因型A）、大包膜蛋白L（ayw亚型，基因型C）、形成HBV衣壳的全长核心蛋白Core_1-183（基因型C）、C端截短的核心蛋白Core_1-149（基因型D）以及病毒聚合酶逆转录酶结构域（RT(pol)）的共有序列。这些序列经过优化，以覆盖已知的HBV表位，同时保持与自然病毒序列一致，以确保正确折叠和加工。各蛋白之间通过优化的P2A和T2A位点连接，允许从单一mRNA等摩尔翻译单个蛋白。Western印迹和ELISA检测证实，转染HepG2细胞后，DNA-HBVac能正确表达并分泌所有编码的HBV抗原。

DNA初免在HBV易感小鼠中的免疫原性

在HBV易感小鼠中，研究者比较了DNA初免-MVA加强方案与经典蛋白（HBsAg+HBcoreAg）初免方案的免疫反应。结果显示，所有方案均能诱导显著的抗HBcore抗体反应。然而，与蛋白初免可诱导高达10⁵mIU/ml的高水平抗HBs抗体不同，DNA初免（50 μg或100 μg剂量）诱导的抗HBs抗体滴度平均低3个log₁₀。在细胞免疫方面，DNA初免（特别是100 μg剂量）可诱导强大的HBV特异性CD4⁺和CD8⁺T细胞反应，其强度与蛋白初免方案相当甚至在某些方面更强。值得注意的是，DNA初免（100 μg）诱导了强烈的RT(pol)特异性CD8⁺T细胞反应，而蛋白初免方案对此反应微弱。此外，由于抗原呈递途径不同，DNA初免主要诱导针对内源性呈递表位S₁₉₀的CD8⁺T细胞，而蛋白初免则主要诱导针对外源性呈递表位S₂₀₈的CD8⁺T细胞。这些数据表明，DNA-HBVac初免能在HBV易感小鼠中引发与重组蛋白相当的强大多特异性T细胞免疫，但诱导的中和抗体反应较差。

DNA初免在HBV携带小鼠中的抗病毒效力评价

在建立持续HBV复制的AAV-HBV小鼠模型中，研究者评估了DNA初免-MVA加强方案在打破免疫耐受和控制病毒感染方面的效力。结果显示，高剂量（100 μg）DNA初免能够诱导强大的HBV特异性CD8⁺T细胞反应，有效降低血清HBeAg水平，并清除大量HBV感染的肝细胞，其抗病毒效果与使用重组HBsAg和HBcoreAg混合蛋白初免的方案相当。然而，DNA初免诱导的抗HBs抗体滴度极低，导致循环HBsAg水平降低不显著。相比之下，使用佐剂化重组蛋白（特别是HBsAg+HBcoreAg混合物）初免的方案，能诱导高水平的抗HBs抗体，并导致血清HBsAg的大幅下降（>3-log₁₀）。这证实，虽然DNA初免能成功引发有效的抗病毒CD8⁺T细胞反应，但要获得满意的HBsAg血清学转换和病毒清除，仍需额外接种佐剂化HBsAg以激发足够的中和抗体。

DNA与HBsAg联合初免策略的探索

为克服DNA疫苗抗体反应弱的缺陷，研究者探索了将DNA-HBVac与重组HBsAg联合用于初免的策略，分为同时接种和序贯接种两种方式。

1. 1.
   同时接种：将DNA-HBVac与佐剂化HBsAg混合后同时注射。此方案虽能诱导出与蛋白初免方案相当的强效抗HBs抗体反应，并有效降低血清HBsAg，但意外地完全抑制了DNA疫苗介导的免疫反应。小鼠未能产生针对Core和RT(pol)抗原的特异性CD8⁺T细胞反应，抗HBcore抗体也为阴性，对血清HBeAg和感染肝细胞数量的影响微乎其微。这表明，在佐剂化蛋白存在的情况下，DNA疫苗的免疫原性被“沉默”了，免疫应答偏向了重组蛋白抗原。
2. 2.
   序贯接种：分先后顺序接种DNA-HBVac和佐剂化HBsAg，再以MVA-HBVac加强。研究者测试了两种顺序：
   • •
     先DNA后HBsAg（DNA₁₀₀/S）：此方案诱导了高滴度的抗HBs抗体和强大的中和活性，能显著降低血清HBsAg水平。同时，它支持了强烈的、由DNA疫苗介导的多特异性CD8⁺T细胞反应（针对S、Core和RT(pol)），并有效降低了血清HBeAg和感染肝细胞数量。
   • •
     先HBsAg后DNA（S/DNA₁₀₀）：此方案也能诱导高滴度抗HBs，但其中和活性及降低血清HBsAg的效果弱于DNA先行的方案。更重要的是，其诱导的Core和RT(pol)特异性CD8⁺T细胞反应非常微弱，清除感染肝细胞的效果也较差。

结论与讨论

本研究表明，在治疗性乙肝疫苗TherVacB的异源初免-加强框架下，DNA疫苗可作为重组蛋白的有效替代品用于初免，尤其擅长诱导广泛、强效的HBV特异性CD8⁺T细胞免疫，包括针对难以生产的抗原（如RT(pol)）的反应。DNA疫苗的热稳定性、低成本和生产简便性是其突出优势。然而，其诱导中和性抗HBs抗体反应的能力不足，是限制其单独应用以实现功能性治愈的主要障碍。

研究的关键发现在于，通过优化接种策略，可以克服这一局限。同时接种DNA和佐剂化HBsAg会抑制DNA的免疫原性，而序贯接种（特别是先DNA后HBsAg的顺序）则能协同激活体液免疫和细胞免疫，产生高滴度、具有强中和能力的抗HBs抗体，同时维持强大的多抗原特异性CD8⁺T细胞反应，从而在HBV携带小鼠模型中实现有效的抗病毒控制。

这项工作不仅验证了DNA疫苗平台在治疗性乙肝疫苗中的应用潜力，更重要的是，它揭示了在多组分异源初免-加强疫苗方案中，免疫接种的顺序至关重要，能显著影响所诱导免疫反应的数量和质量。这为设计下一代能同时激发有效抗体和T细胞反应、以实现慢性乙肝功能性治愈的治疗性疫苗提供了重要的临床前依据和优化策略。