SARS-CoV-2病毒衣壳C端向外暴露的包膜蛋白：开启病毒-细胞互作新通路

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：C-terminus-outward orientation of SARS-CoV-2 envelope proteins on viral capsid enables a novel virus–cell interaction pathway

本研究首次在活体病毒上证实了新冠病毒（SARS-CoV-2）包膜蛋白（E-pr）在其衣壳表面呈C末端向外（Ct-out）的取向，并揭示了其暴露片段（EC38）能够与人血管内皮细胞结合并调控基因表达，发现了包括CKAP4、ATP5B在内的潜在宿主相互作用蛋白，为理解新冠病毒感染机制及其导致的血管相关疾病（如凝血功能障碍、高血压）提供了新视角，并提示E-pr可作为潜在的干预靶点。

　　

引言

自COVID-19大流行开始以来，研究焦点主要集中在刺突蛋白（S蛋白）上，而严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的其他分子，如包膜蛋白（E-pr），在很大程度上被忽视了。本研究旨在确定E-pr在活SARS-CoV-2病毒包膜中的取向，并确认病毒E-pr是否在宿主细胞的附着和刺激中发挥作用。

材料与方法

研究设计

这是一项初步研究，首先确认SARS-CoV-2衣壳中E-pr的取向，其次确认病毒表面暴露的E-pr外部部分（如EC₃₈片段）是否在结构或功能上参与了生命系统中的病毒-宿主细胞相互作用。由于缺乏针对EC₃₈片段的商品化抗体，研究通过用合成的EC₃₈肽免疫C57BL/6小鼠，制备了自制的抗EC₃₈血清。为了检查完整病毒中EC₃₈片段是位于病毒衣壳外部还是内部，使用了两种策略。第一种策略将灭活的SARS-CoV-2病毒附着到固定的293T-ACE2hR细胞上，对其中一组进行Triton X-100渗透，以允许抗体进入病毒和细胞内的抗原。第二种策略将抗EC₃₈和抗MN₁₉抗血清偶联到Protein A琼脂糖上，与活病毒或灭活病毒孵育，然后通过逆转录-PCR检测捕获的病毒。

在功能研究中，使用培养的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）作为血管内皮模型。用EC₃₈肽处理HUVEC后，通过RNA-seq测量其转录组变化，同时通过下拉实验结合质谱法检测EC₃₈肽在HUVEC细胞膜上的相互作用组。通过生物信息学分析两组数据，建立E-pr参与COVID-19血管内皮功能相关发病机制的相互作用方案。

结果

1. SARS-CoV-2 E蛋白的C端半段在人和小鼠中具有免疫原性

根据大多数研究和程序预测，75个氨基酸长的SARS-CoV-2 E-pr大致分为两半：一个37个氨基酸长的N端半段和一个38个氨基酸长的C端半段（EC₃₈）。与预测一致，COVID-19患者恢复期约1个月的血清显示出抗EC₃₈反应性，以及对合成的MN₁₉肽和重组S蛋白的反应性。同样，用EC₃₈肽免疫具有免疫活性小鼠后，其血清也显示出针对EC₃₈肽的抗体反应，确认E-pr的C端半段在体内具有免疫原性。

2. E蛋白在SARS-CoV-2病毒包膜中呈C端向外的取向

通过两种实验证实了EC₃₈片段位于病毒包膜外部。在第一种设置中，使用抗EC₃₈血清、抗MN₁₉血清或商业抗核衣壳蛋白（NP）抗体对固定的病毒-细胞复合物进行免疫荧光染色。结果显示，无论是否进行渗透处理，抗EC₃₈和抗MN₁₉抗体均能产生阳性染色信号，而抗NP抗体则不能对未渗透的样本产生阳性染色。在第二种实验中，将抗血清偶联到琼脂糖珠上捕获病毒。结果显示，抗EC₃₈血清能有效捕获活病毒和灭活病毒，而抗MN₁₉血清捕获病毒的能力仅在边缘水平，无统计学意义。这些数据共同证明，E-pr的EC₃₈片段位于病毒包膜外部，可以被外源性抗体接近。

3. E蛋白的外段在体外结合于人血管内皮细胞

鉴于在重症COVID-19患者中观察到的病毒血症症状，使用培养的HUVEC作为循环系统的细胞模型，测试EC₃₈肽与HUVEC的结合及其对转录组的潜在影响。EC₃₈肽以剂量依赖性方式与HUVEC细胞结合，而MN₁₉肽则没有表现出这种结合。使用流式细胞术比较代表EC₃₈不同部分的四个较短肽段（EN、EC、EM、EL）与HUVEC的结合，发现所有细胞对EC₃₈肽表现出不同的结合亲和力，而对四个短肽的结合能力则相对一致且呈序列依赖性。

4. E蛋白的外段（EC₃₈）调控人血管内皮细胞的基因表达

用EC₃₈肽处理HUVEC 24小时后，通过RNA测序测量其转录组变化。在15,964个注释基因中，74个基因被归类为上调，66个基因下调超过1.5倍。对改变的基因进行通路富集分析显示，在EC₃₈肽处理的细胞中，“止血”和“激素对体循环动脉血压的调节”是调控基因中富集度最高的功能类别。这有助于解释在COVID-19患者中记录的凝血障碍和高血压。相比之下，MN₁₉肽处理诱导的差异表达基因中，只有约六分之一与EC₃₈肽诱导的基因重叠，表明M-pr和E-pr的外段在刺激HUVEC方面没有实质性重叠。

5. HUVEC中多种膜相关蛋白与EC₃₈外段相互作用

为了探索HUVEC中可能与EC₃₈片段相互作用的蛋白模式，使用EC₃₈肽偶联珠从HUVEC细胞（包括各种膜和细胞质）制备的总蛋白中进行下拉。质谱分析和数据处理后，鉴定出结合蛋白。其中，位于质膜的112个蛋白（PM112）的富集分析显示，“肌动蛋白细胞骨架组织”和“细胞-细胞相互作用”是最显著富集的功能蛋白类别。将EC₃₈结合蛋白的富集术语与EC₃₈调控基因的富集术语进行比较，发现11个共享的基因本体术语，包括“上皮细胞分化”、“细胞-细胞粘附”、“止血”、“病毒感染通路”、“免疫系统中的细胞因子信号传导”等，暗示EC₃₈肽或E-pr可能通过这些通路对人血管系统的内皮产生生物学效应。

研究特别关注了三个非经典的膜相关蛋白，即细胞骨架相关蛋白4（CKAP4）、波形蛋白（vimentin）和ATP5B，并通过Western印迹或ELISA证实了它们与EC₃₈肽的结合相互作用。与EC₃₈-ATP合酶在HUVEC中偶联的假说一致，E-pr五聚体的预测3D结构与ATP合酶的随机对接表明，C端部分倾向于结合到ATP合酶的“头部”部分。具体而言，E-pr五聚体倾向于位于ATP合酶α和β亚基之间的空腔内，其C端螺旋和环结构可以延伸，与ATP合酶复合体的极性和带电表面形成更多相互作用。

讨论

本研究通过实验证明E-pr在SARS-CoV-2病毒表面采用Ct-out的取向，使得其38个氨基酸长的外段能够以不同于先前已知的方式（例如在细胞内的ERGIC中）参与病毒-宿主相互作用。首先，阐明E-pr在病毒膜上的Ct向外取向证实，当考虑将E-pr作为疫苗开发靶点时，只需考虑EC₃₈片段。与S蛋白的高变异率相比，E-pr表现出较低的变异率。其次，通过鉴定内皮细胞中E-pr的一系列潜在相互作用物，本研究强调了E-pr启动的反应对伴随COVID-19的止血相关血管疾病的潜在贡献。在识别的所有潜在E-pr受体中，未先前注释为“膜蛋白”的蛋白质值得特别注意，例如CKAP4、波形蛋白和ATP合酶亚基ATP5B。尽管ATP合酶传统上被认为是线粒体限制性的，但最近证据表明，它在包括癌细胞和内皮细胞在内的几种细胞类型中易位到细胞质膜外表面，作为多种生理分子（如血管抑素、载脂蛋白A-I等）的受体。异位ATP合酶也被证明可以结合HBV、HIV-1、HEV等病原体。本研究为支持SARS-CoV-2病毒与内皮细胞（包括E-pr-异位ATP合酶）之间相互作用的新证据增添了内容。最后，由于血压升高被认为是自然COVID-19感染或疫苗接种的重要即时和延迟后果，因此有必要强调“GO:0001990，激素对体循环动脉血压的调节”在EC₃₈调控基因中显著富集。当前的研究结果将E-pr列为COVID-19诱发高血压的新怀疑对象。

总之，这项研究证实了E-pr在SARS-CoV-2病毒表面采用C端向外的取向，使其外段能够以新的方式参与病毒-宿主相互作用。病毒表面大刺突的稀疏性为短的EC₃₈片段提供了更多立体空间，使其能与宿主细胞表面假定的相互作用物结合。然而，需要广泛的研究来证实这些假定的相互作用在实际感染背景下的意义，无论是在血管内皮还是其他细胞或组织中。对这些问题的回答可能引出利用E-pr作为靶点的策略，以阻止外源病毒附着于宿主细胞，或干扰宿主细胞中刺激引发的信号传导。