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这篇综述系统性地总结了近年来单细胞转录组学在揭示小鼠和人类牙齿发育过程中细胞异质性、谱系轨迹及分子信号网络方面取得的前沿进展。文章深入探讨了釉质、牙本质-牙髓及牙周组织形成的细胞学基础与关键调控机制，并阐述了这些发现如何为基于干细胞、类器官和生物材料的牙及牙周组织功能再生策略提供了新的理论基础与先进思路。
牙齿发育是一个持续、高度协调的过程，是剖析器官发生细胞与分子机制的理想模型。近年来，单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的进步，为在单细胞水平上解析牙齿发育的细胞景观、谱系命运和信号网络提供了前所未有的洞察，极大地增进了我们对牙齿发生的理解。更为关键的是，这些研究为牙齿与牙周组织的功能再生奠定了理论基础并指明了先进策略。
组织架构：牙齿发育的基础
类似于大多数外胚层来源的器官，牙齿形态发生由持续、精细调控的上皮-间充质相互作用驱动。该过程始于口腔上皮增厚，随后形成具有牙源性潜能的牙板。有趣的是，在此阶段，将牙板上皮与非牙源性间充质重组，就足以自主启动牙齿形成。随后，牙板上皮内陷进入下方的颅神经嵴（CNC）来源的间充质，形成牙蕾，牙源性间充质细胞在牙胚周围聚集。接着，上皮将其牙源性潜能转移给间充质区室，协调后续的牙齿发育阶段。上皮成分在各种信号因子的影响下分化为釉质，其折叠模式决定了牙尖的形状和数量。间充质区室进一步分化为牙乳头和牙囊。位于釉质下方的牙乳头产生牙本质，并参与牙根的发育和伸长。随着牙根形成，被牙冠釉质和牙本质包绕的那部分牙乳头继续成熟为牙髓——一个高度血管化和神经支配的结构。包绕发育中釉质、牙本质和牙乳头的牙囊，负责形成牙骨质、固有牙槽骨和牙周韧带，并且是牙齿萌出的关键效应组织。
总体而言，牙齿形态发生例证了动态的上皮-间充质对话如何协调复杂的组织模式，为理解器官发生和指导再生策略提供了概念框架。
釉质的形态发生与再生
釉质是人体最坚硬的组织。在诸如小鼠切牙等某些动物中，釉质上皮干细胞持续产生功能性的成釉细胞，使得釉质能够再生。这一特性使小鼠切牙成为研究牙齿发育的理想模型。然而，小鼠与人类牙列之间存在显著差异。在人类中，釉质缺乏干细胞龛，一旦受损便无法自我修复。
除了成釉细胞谱系，釉质形成器官还包括多种支持细胞群。在scRNA-seq技术出现之前，这些支持细胞在成釉细胞分化和功能成熟中的作用尚不清楚。近期的scRNA-seq研究已开始阐明人类和小鼠牙胚发育过程中异质性上皮群体的分子特征和分化轨迹，并提出了人类釉质再生的新策略。
一项研究利用scRNA-seq调查了孕9至22周的人类胎儿牙齿发育，识别出13个参与釉质形成的上皮细胞群：口腔上皮（OE）、牙上皮（DE）、釉结（EK）、外釉上皮（OEE）、内釉上皮（IEE）、颈环（CL）、内中间层（SII）、外中间层（SIO）、内星网状层（SRI）、外星网状层（SRO）、前成釉细胞（PA）、早期成釉细胞（eAM）和分泌期成釉细胞（sAM）。伪时间分析表明，OE直接分化为DE，DE随后产生EK和星网状层谱系（SIO和SRI）；同时，OEE谱系产生SII、SIO、IEE、PA、eAM和sAM细胞。釉结已被确定为人类牙齿形成过程中不可或缺的信号中心，在牙冠形态发生中扮演着关键角色。支持细胞，如SII（通过Hedgehog和Wnt通路）和SIO（通过TGF-β通路），似乎对成釉细胞谱系内特定的邻近上皮细胞群施加精确的信号影响。
研究还发现，富含亮氨酸重复序列G蛋白偶联受体6（LGR6+）细胞定位于OEE和IEE交界处的颈环。先前研究报道，成年小鼠切牙的颈环区域含有上皮干细胞。颈环处的LGR6+细胞可以产生赫特威希上皮根鞘（HERS），在牙根形成中起关键作用，并可能在牙冠发育早期阶段参与成釉细胞的形成。然而，人类釉质发育缺乏持续维持的颈环龛，这是实现体内釉质再生的一个根本限制。
分子信号方面，研究发现，在从OE向DE的转变过程中，下方的牙源性间充质细胞分泌BMP、ACTIVIN和非经典WNT配体，而经典WNT配体则在OE内产生。在从DE向OEE的转变过程中，DE和EK分泌WNT配体，而BMP和FGF配体主要来源于牙源性间充质。釉结分泌SHH、WNT10A和WNT10B。在从OEE向IEE的转变过程中，下方的牙乳头主要通过分泌BMPs影响成釉细胞分化。在前成牙本质细胞（POB）、成牙本质细胞（OB）和上皮细胞之间的相互作用尤为突出，FGF和BMP的分泌促进了PA向eAM或sAM的转变。在成釉细胞分化的后期阶段，PA和SII分泌Hedgehog（HH）配体，而SRI和SIO产生TGF-β配体。随后，在从eAM到sAM的最终成熟过程中，WNT配体主要由eAM细胞分泌，EGF由SII分泌，FGF由SIO分泌。这些配体的分泌不仅促进成釉细胞成熟，还可能影响间充质组织的发育。总体而言，WNT、TGF-β、HH、FGF和BMP信号通路在成釉细胞分化过程中最为活跃，突显了间充质细胞在协调上皮组织发育中的关键作用。
有趣的是，在从OEE向IEE的转变过程中，WNT活性与SP6表达相关。SP6最初定位于IEE和PA细胞的细胞质中，随后在eAM和sAM中表达，并最终转位到细胞核，与AMBN表达共定位。先前研究报道，WNT信号可以诱导转录因子SP6的表达，而SP6进而作用于AMBN和AMELX的启动子。这一发现强调了WNT诱导的SP6表达在协调成釉细胞成熟中的关键作用。
小鼠切牙釉质形成的细胞基础
组织学分析传统上识别了小鼠切牙中的四种主要上皮细胞类型。研究表明，在小鼠切牙发育过程中，受FGF8信号调控的Sox2+干细胞特异性定位于颈环。这些细胞产生Sfrp5+祖细胞，后者进而产生所有参与釉质形成的上皮谱系，从而驱动小鼠切牙的持续釉质发育。研究进一步探索了Sox2+干细胞的异质性，并发现Lgr5+细胞是Sox2+区室内的一个亚群，是在Sox2+细胞消融后最先重新增殖的细胞。此外，Pitx2、Sox2、Lef1、Irx1和Nephronectin等调控因子被证明在维持Sox2+干细胞的稳态平衡中至关重要。谱系追踪研究还确定了Bmi1+上皮干细胞是通过Bmi1介导的Ink4a/Arf和Hox基因表达的抑制来维持正常釉质形成的关键调控因子。
另一项研究利用基于Smart-seq2的单细胞转录组分析，生成了小鼠切牙上皮的综合细胞图谱。在Krt14+/Cdh1+上皮区室内，他们识别出13个转录不同的亚群。其中，Shh+、Enam+、Klk4+和Gm17660+细胞分别对应于成釉细胞分化的分泌前、分泌期、成熟期和成熟后阶段，从而重建了成釉细胞谱系进展的完整发育轨迹。此外，他们证明中间层细胞在维持血管-成釉细胞界面方面起着关键作用，这对于正常的釉质形成至关重要。一致地，通过scRNA-seq分析进一步证实了小鼠切牙上皮内存在成釉细胞、内釉上皮/外釉上皮和中间层/星网状层群体，并将分泌期成釉细胞细分为Dspp+和Ambn+亚群，分别代表早期和完全分化的分泌期成釉细胞状态。
历史上认为，位于小鼠切牙颈环的慢周期上皮干细胞产生内釉上皮细胞，随后分化为所有参与釉质形成的上皮谱系。然而，scRNA-seq研究揭示，在小鼠切牙的正常釉质发育过程中，大多数内釉上皮和中间层细胞分化为成釉细胞，而一小部分则产生星网状层和外釉上皮细胞。然而，在损伤或稳态破坏时，中间层细胞获得了直接转化为内釉上皮和成釉细胞的能力。机制上，NOTCH1信号是介导这种转化的关键调控因子，而Cldn10可能促进中间层细胞的离子渗透性，从而促进釉质形成。
牙本质-牙髓与牙周发育的细胞基础及其再生方法
在人类早期牙齿发育中，研究描述了牙源性间充质细胞的异质性，识别出六个不同的间充质群体：牙乳头（DP）、前成牙本质细胞（POB）、成牙本质细胞（OB）、成牙本质细胞下层细胞（SOB）、外胚间充质（DEM）和牙囊（DF）。基因本体分析显示，牙乳头和外胚间充质富含信号传导、形态发生、发育起始和模式形成通路，提示它们作为祖细胞群的作用。前成牙本质细胞以增殖和命运决定特征为标志；牙囊细胞显示细胞外基质形成相关基因富集；成牙本质细胞下层细胞表达与细胞聚集、运动和迁移相关的基因；而成牙本质细胞则表现出与牙本质发生、牙组织形成和矿化相关的基因程序。
伪时间分析进一步证实了牙源性间充质内存在两个祖细胞群：牙乳头和牙囊。牙乳头产生前成牙本质细胞和成牙本质细胞，而牙囊产生稀疏的牙囊样细胞。这两个祖细胞都来源于PRRX1+的外胚间充质细胞。在孕13周时，牙髓主要来源于牙乳头，外胚间充质定位于牙髓的根尖区域。有趣的是，稀疏的牙囊样细胞在早期牙髓中（孕13周前）已经存在，提示牙囊可能参与了牙髓和牙本质的发育。
在另一项针对孕17-24周人类牙胚的研究中，牙源性间充质被分为七个亚群，但这些群体之间的相互关系及其具体功能作用仍有待探索。
对于出生后的人类牙乳头，单细胞RNA测序已识别出八种主要细胞类型。值得注意的是，早期间充质干细胞群体表现出SEPTIN基因的表达，这可能赋予这些细胞更强的增殖和分化潜能。为探索牙乳头来源间充质干细胞的成骨潜能，一项研究利用scRNA-seq调查了化学诱导成骨过程中的转录变化，识别出一个具有显著成骨活性的DIO2+亚群。然而，DIO2+细胞的分离和体外培养系统尚未建立，这可能大大限制这些发现的转化意义。
在牙周组织方面，对人类出生后牙囊组织的单细胞RNA测序识别了多种细胞类型，其中以SPARC和骨膜蛋白（POSTN）为标志的牙囊干细胞是驱动牙骨质、牙周韧带和牙槽骨形成的主要效应细胞。研究进一步将PDGFRA确定为牙囊干细胞内牙源性祖细胞群体的标志物。除了分化和直接参与牙周组织形成外，PDGFRA+牙囊干细胞受内皮细胞衍生的PDGF-BB信号调控，从而促进CD31+/EMCN+脉管系统的形成。此外，培养PDGFRA+牙囊干细胞聚集体增强了牙周缺损中血管生成和成骨的耦合，从而加速了牙槽骨再生。
另一项研究在牙囊细胞间建立了基因调控网络，并识别出四个参与牙齿发育和微环境调控的调控模块，强调了血管和免疫成分如何通过胶原蛋白-CD44和ANGPTL1-ITGA/ITGB信号协调牙周发育。
小鼠牙髓和牙本质发育的细胞结构
过去几十年的研究利用遗传小鼠模型，已经识别出几个参与切牙和磨牙发育的关键细胞群体。神经血管束内的感觉神经分泌Shh蛋白，激活Gli1+血管周围细胞，并促进所有牙源性间充质细胞的产生，在小鼠牙髓和牙本质的发育中起着至关重要的作用。在成年小鼠切牙中识别出的一个Runx2+/Gli1+亚群，通过IGF信号调节扩增细胞的增殖和分化以及切牙的生长速率，从而有助于间充质干细胞龛的维持。
PRX1是颅面发育中常用的间充质干细胞或祖细胞群的标志物。scRNA-seq研究揭示，在小鼠第一磨牙从胚胎期13.5天到出生后7.5天的发育过程中，Prx1+细胞最初聚集并显示在牙源性间充质中的特定分布。然而，到钟状期，它们的数量下降。有研究提出，Prx1+细胞通过分泌Wnt5a来调节磨牙形态发生，同时促进牙源性间充质细胞的增殖。然而，在整个观察到的小鼠牙齿发育阶段，Prx1+细胞在第三磨牙胚中并未显著检测到，提示可能有额外的干细胞亚群参与磨牙形态发生。
scRNA-seq的应用提供了对小鼠牙齿发育细胞基础更全面的理解。研究揭示，小鼠磨牙的形成是由空间组织的Cd24a+/Pax9+祖细胞核心协调的，其中Cd24a+细胞产生牙髓-牙本质复合体，而Pax9+细胞主要贡献于牙周组织。在从牙冠向牙根过渡期间，受牙槽骨来源的PDGFB引导，Cd24a+/Pax9+细胞逐渐集中在牙根区域，集体迁移形成牙根。值得注意的是，在人类牙齿发育过程中也观察到了类似的Cd24a+/PAX9+细胞群体。
另一项研究对胚胎期13.5天至出生后7.5天的小鼠磨牙进行了scRNA-seq分析。在胚胎期13.5天，牙源性间充质表达Tfap2b和Lhx6，代表了此阶段相对同质的祖细胞群。到胚胎期14.5天，Pax9+牙源性间充质细胞可进一步细分为Crym+/Egr3+/Fgf3+牙乳头细胞和牙囊细胞。到胚胎期16.5天，当磨牙达到钟状期时，牙乳头和牙囊区室内部都出现了细胞异质性。到出生后3.5天，小鼠磨牙牙根准备开始形成，牙源性间充质内可以观察到六个不同的细胞群体。到出生后7.5天，牙源性间充质的空间组织和相应的标志基因与出生后3.5天时基本一致，表明牙根形成的细胞结构在出生后3.5天时已经建立。
单细胞转录组学揭示小鼠牙齿再生中的关键间充质亚群
在胚胎期11-13天的小鼠中，牙源性信号从牙上皮转移到下方的间充质。先前研究表明，非牙源性上皮——包括人类角质形成细胞、人类牙龈上皮细胞，甚至人类胚胎干细胞来源的上皮片——都可以对牙源性间充质信号做出反应，共同促进牙齿形成。研究报道，在胚胎期12.5天，小鼠切牙和磨牙牙胚之间的
