多瑙河湿地地表水-地下水过渡带原生生物群落动态变化、驱动因子与生态意义研究

《Frontiers in Microbiology》：Dynamic changes in protist community composition along a surface water-groundwater transect in the Danube wetland Lobau, Vienna, Austria

本综述聚焦奥地利维也纳多瑙河湿地生态系统中，地表水与浅层地下水在微生物多样性、群落动态和生态功能方面的过渡性差异，通过长达两年的月度采样（DNA与RNA分析）揭示了原生生物（Protist）群落沿水文梯度呈现显著空间分异与季节性同步变化，阐明了环境过滤和地表水补给对地下水中原生生物组成的关键驱动作用，并为理解湿地生态系统生物地球化学循环提供了重要的微生物视角。

　　

1 引言

在陆地-水域过渡区域探究微生物群落结构对于理解群落组装、环境适应、生态系统过程乃至地球生命多样性至关重要。地表与地下水在水文循环中的交换过程深刻影响着生物地球化学通量和生物多样性格局。作为微观真核生物的重要类群，水生原生生物具有复杂的系统发育关系、多样的营养模式（包括自养、混合营养、异养）和广泛的生态功能，是连接微生物世界与大型水生/陆地生物群落的关键纽带。然而，与相对深入研究的海洋、湖泊等环境相比，地下水作为原生生物栖息地的探索仍显不足，相关研究多局限于污染羽流或非典型含水层，且方法上多依赖传统的形态学鉴定或低通量分子技术。因此，运用高通量测序（如18S rDNA V9区测序）揭示地下水中原生生物群落的组成、动态及其环境驱动机制，对于填补这一知识空白、建立基线数据以应对气候变化和人为干扰具有重要科学意义。本研究选取奥地利维也纳多瑙河漫滩国家公园内一处牛轭湖（地表水，ESW）和相距25米的浅层地下水井（D15）为对象，进行了为期两年（2020年夏至2022年夏）的月度采样，通过同步分析DNA（代表总群落）和RNA（代表活跃群落）来系统比较两栖地中原生生物群落的差异与联系，并检验了如下假设：(i) 两栖地环境条件与原生生物群落组成存在明显差异；(ii) 地下水原生生物多样性低于地表水；(iii) 非光合自养类群在地下水占主导；(iv) 地表水群落季节性动态更显著；(v) 冬季地下水与地表水群落的相似性更高。

2 材料与方法

2.1 采样与研究区域

研究在多瑙河湿地维也纳段的国家公园Lobau进行。每月采集一处牛轭湖地表水（ESW）和一口10米深的浅层地下水井（D15）的水样，二者代表了地表水与地下水环境条件的极端差异。利用三角测量法基于水力水头（米海拔）确定了监测井间的地下水流向与水力梯度。

2.2 样品采集

使用潜水泵从D15井6米深处抽取地下水，置换井水直至温度、溶解氧（DO）、电导率（EC）和pH等关键环境参数稳定。地表水样品在湖面下约30厘米采集。用于分子分析的水样在实验室经0.22 μm Sterivex滤膜过滤，滤膜保存于-80°C。

2.3 环境与微生物参数测量

测量了主要离子浓度、温室气体（CO₂、CH₄）、稳定水同位素（δ¹⁸O、δ²H）、溶解有机/无机碳（DOC/DIC）。微生物活性以内源性三磷酸腺苷（ATP）为指标，原核细胞总数（TCC）通过流式细胞术测定。

2.4 DNA/RNA提取与测序

采用优化的苯酚-氯仿法共提取RNA和DNA。对DNA提取物和经反转录的cDNA，使用1380F/1510R引物对18S rDNA的V9区进行扩增和Illumina测序。使用DADA2流程处理原始序列获得扩增子序列变异（ASV），并基于PR2数据库进行分类学注释。

2.5 统计分析

在R环境中进行数据分析和可视化。基于采样月份定义季节（冬、春、夏、秋）。通过物种累积曲线、香农多样性指数、主成分分析（PCA）等方法评估多样性。群落组成差异采用基于中心对数比（clr）转换后的欧氏距离（对应Aitchison距离）进行分析，并通过PERMANOVA检验显著性。利用约束主坐标分析（CAP）和方差膨胀因子筛选探讨群落组成与环境变量的关系。通过LEfSe分析识别差异丰度类群，并利用“microbiome”包（定义：在>75%的样本中出现）鉴定两栖地的核心ASV。

3 结果

3.1 采样点特征

环境条件受栖息地类型（地表水vs.地下水）和季节共同塑造。与地表水相比，地下水具有更高的CO₂浓度、DIC、硫酸盐和正磷酸盐，但微生物活性（ATP）、原核细胞密度（TCC）、DOC、DO、pH和铵盐浓度则显著更低。CO₂、DOC、DO、pH和温度在两栖地均表现出明显的季节性动态，但地下水温度变化存在短暂滞后。稳定水同位素（δ¹⁸O、δ²H）趋势高度相似，且水力水头差表明地表水在几乎所有时间点都在补给浅层含水层，水流方向单向，但补给速率在快慢之间交替，无明显季节性趋势。

3.2 原生生物群落多样性与丰富度

物种累积曲线表明，无论是地表水还是地下水的原生生物群落均未因当前采样量而达到平台期。地表水的ASV丰富度高于地下水，但两栖地间的香农多样性指数并无显著差异。季节性能显著解释DNA群落的多样性变化。地表水多样性变化与铵盐（负相关）和硝酸盐（正相关）相关，而地下水多样性则与温度、DO、pH、CO₂、CH₄和ATP等变量关联。

3.3 原生生物群落的季节动态

地下水活跃群落（RNA）的物种周转率显著高于总群落（DNA）。无论是DNA还是RNA群落，地表水与地下水的群落组成均存在显著差异。群落组成呈现清晰的年度循环，从夏季组合过渡到冬季组合，并包含春秋季的转换。2021年和2022年的夏季组成与初始的2020年8月组成更为相似，而与冬季组成明显不同。两栖地间的差异在整个研究期间保持稳定。总群落（DNA）组成与温度、微生物活性和CO₂等季节性环境变量相关，而活跃群落（RNA）则还与DOC、NO₃^-和CH₄相关。

3.4 群落组成

在相对丰度上，两栖地共享的ASV构成了各自群落的主要部分（DNA：68.6%；RNA：62.4%）。地下水拥有较小的核心群落（46个ASV），以金藻纲（Chrysophyceae）和动质体目（Kinetoplastida）为代表。地表水的核心群落（150个ASV）则大得多，包括硅藻（Bacillariophyta）、等辐骨虫纲（Dictyochophycea）、隐藻、金藻和卵菌（Oomycota）。在基因拷贝数（GCN）水平上，藻界（Ochrophyta）和纤毛虫（Ciliophora）是两栖地最丰富的原生生物门类。藻界相对丰度在地表水更高，而纤毛虫GCNs则在地下水、特别是活跃群落中占比更大。地表水纤毛虫以旋毛纲（Spirotrichea）为主，地下水则以寡膜纲（Oligohymenophorea，如四膜虫属Tetrahymena）和大量未分类纤毛虫为主。地表水更倾向金藻纲、硅藻、等辐骨虫纲和合尾金藻纲（Synurophyceae），而地下水则与眼点藻纲（Eustigmatophyceae）关联。鞭毛虫类（隐藻、定鞭藻、绿藻、领鞭毛虫、Katabiepharidaceae）与地表水相关。有孔虫（Cercozoa）在两栖地均有出现，但地表水以有壳丝足纲（Filosa-Thecofilosea）为特征，地下水则以肉足纲（Filosa-Sarcomonadea）为主。其他在地下水显著更富集（存在和活性上）的类群包括眼虫门（Euglenozoa）和阿普斯单胞虫科（Apusomonadidae）Group 1。

3.5 特定类群的季节趋势

多个类群表现出与特定年份时期（冬/夏）的关联。例如，原始叶足纲（Archamoebea）和未分类的羽变形虫门（Conosa）在地下水夏季丰度达到峰值。丝足纲-有壳类（Filosa-Thecofilosea）在两栖地均在冬春季最优。Katabiepharidaceae在地表水全年稳定，但在地下水总群落和活跃群落中显示冬季高峰。Bolidophyceae和阿普斯单胞虫科Group 1在地下水活跃群落的响应滞后于总群落。寡膜纲在地表水表现出明显的冬季高峰，但在地下水活跃群落中波动更为剧烈。

4 讨论

4.1 地点专一性与环境过滤

水动力和稳定同位素数据表明地表水全年都在补给浅层地下水，水力联系持续存在。尽管存在这种连通性，原生生物的总群落和活跃群落在组成上均表现出稳定的地点专一性，且年度间群落轨迹一致、季节模式重复出现，表明主导的时间信号反映了稳定的、栖息地特异的生态过程，而非短期随机事件。群落变化与CO₂、CH₄、NO₃^-等季节性生物地球化学过程联系更紧密，而非直接与电导率（作为地表水入渗的指标）相关。研究结果拒绝了冬季两栖地群落更相似、地下水季节性动态更弱的假设。观测到的显著季节性可能与含水层较浅、受地表温度波动影响较大有关，也可能与较易利用的溶解有机质输入刺激夏季微生物活动有关。光合营养类群在地下水中的出现支持了连续连通性，但其季节性可能因补给之外的因素而被加剧。

4.2 地下水特异性原生生物类群

地下水核心群落较小，表明仅有有限类群能够在该环境中持续生存。动质体目的持续检测与早期研究一致，其小细胞、浮游生活和对低猎物可利用性的适应能力可能是其持续存在的原因。在相对丰度上，两栖地共享类群贡献巨大，这可能得益于水体的邻近性与持续水力连通性，地表水作为生物来源，但仍受栖息地过滤和季节性动态影响。群落组成的地点特异性主要体现在纤毛虫与藻界比例的差异上。地下水富含纤毛虫（特别是寡膜纲、肾形纲、篮口纲、臂口纲），但鉴于纤毛虫rRNA基因拷贝数（GCN）变异大，此结果需谨慎解读。尽管如此，本研究的平行采样与处理流程支持了跨栖息地的可比性。纤毛虫的优势可能与含水层（混合粗砾石、砂、粉砂粘土层）特性有关。寡营养、黑暗的地下水环境难以维持以高捕食需求为特征的纤毛虫/变形虫优势群落，但存在/缺失分析证实了两栖息地群落的差异。其他地下水特异性类群（如阿普斯单胞虫、眼虫、肉足纲等）也在其他含水层或土壤中有报道。研究未立即证实光合营养类群在地下水中的稀缺性，因为藻界在RNA群落中占比较高。该门类包含丰富的功能多样性（专性异养、光合、兼性混合营养），其营养策略常依赖于环境背景。总体而言，异养营养是地下水的主要营养模式，兼有具混合营养潜力和寄生潜力（如顶复门Apicomplexa）的类群，反映了该地点与地表水连通的过渡性质。未分类的羽变形虫门在DNA群落中夏季增加，但RNA代表主要出现在有氧时期，可能与包囊形成或外部输入有关。RNA滞后于DNA信号的现象（如Bolidophyceae、Apusomonadidae）可能指示外部输入，或反映了核糖体RNA周转、休眠期核糖体库维持等生理差异。

4.3 多样性

地下水原生生物丰富度略低于地表水，但香农多样性无显著差异。地表水更高的丰富度可能源于更多外部生物输入，或与更高的生物量/测序深度带来的偏差有关。因此，考虑均匀度的多样性指数可能比丰富度更能稳健估计扩增子多样性。本研究的浅层地下水点位可视为一个具有持续环境变异和定殖机会的过渡带，这或许解释了其多样性与地表水群落差异不大的现象。DNA群落多样性在冬季（特别是2020年12月）趋于一致，支持了此期间连通性增强的假设。然而，基于RNA的活跃群落多样性在冬季却呈现相反的分异模式，且两栖地多样性驱动因子不同，表明两栖地活跃群落的多样性动态更可能是解耦的，而非相互关联。

5 结论

本研究通过分子条形码技术，首次详细刻画了维也纳多瑙河漫滩国家公园内沿地表水-地下水梯度的原生生物群落组成与多样性。长达两年的月度监测揭示了地表水与地下水拥有截然不同但结构稳定的原生生物群落组成与周转模式。地下水的原生生物多样性（特别是基于RNA的活跃群落）表现出与地表水类似的季节性动态。功能上，地下水群落以异养谱系和具已知混合营养潜力的类群（包括纤毛虫）为主。地下水原生生物多样性与原核生物活性及氧化还原条件相关，提示未来需进一步探究食物网相互作用。本研究是应用分子手段分析地下水原生生物群落的先驱工作之一，长期监测及对附着态群落的纳入将对于深入理解地下水原生生物生态学至关重要。