《Frontiers in Genetics》：Potential effects on the signaling network mediated by overexpression of the vitronectin gene in Hu sheep ruminal epithelial cells using multi-omics analysis
多组学整合揭示玻璃粘连蛋白(VTN)在湖羊瘤胃上皮细胞中过表达引发的信号网络效应
背景
瘤胃是反刍动物营养物质吸收与代谢的关键场所，其上皮(RECs)构成了机体与瘤胃内环境的动态界面，不仅负责吸收功能，还在代谢和免疫调节中扮演核心角色。细胞外基质(ECM)蛋白是组织发育和功能维持的基础。其中，玻璃粘连蛋白(VTN)是一种多功能糖蛋白，通过与整合素受体相互作用，驱动细胞黏附、迁移和信号转导等关键过程。在反刍动物中，VTN的表达差异可能通过cAMP/PKA/CREB等通路调节胰岛素信号和葡萄糖代谢，从而维持代谢稳态。先前研究也表明，VTN与饲料效率相关，高效个体血清VTN水平更高。本研究旨在通过构建VTN过表达载体并转染至湖羊RECs，结合转录组学和代谢组学分析，系统探究VTN过表达对细胞功能的全局性调控机制，以期为优化反刍动物瘤胃功能和生产性能提供分子靶点。
材料与方法
实验使用购买的湖羊瘤胃上皮细胞系(iCell-0038a)，设置VTN过表达组和未处理对照组，每组设三个生物学重复。通过分子克隆技术将湖羊VTN基因的编码序列构建到pCAGGS-MCS哺乳动物表达载体中，获得重组质粒pCAGGS-VTN。使用EndoFectin? Max转染试剂将质粒转染至细胞，32小时后收集样品用于多组学分析。
转录组测序在Illumina HiSeq平台进行，使用DESeq2进行差异表达基因(DEGs)分析，并通过topGO和clusterProfiler进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。同时进行了基因集富集分析(GSEA)和RT-qPCR验证。
代谢组学采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)进行非靶向分析，通过主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)评估组间差异，筛选差异代谢物并进行KEGG通路注释。
此外，研究还整合了跨物种进化分析、公开转录组数据集交叉分析以及牛瘤胃上皮单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据，以在更广泛的生物学背景下验证和拓展VTN/ADM基因网络的功能。
结果
VTN过表达诱导RECs的转录组重塑
高质量RNA测序共鉴定出495个差异表达基因(DEGs)，其中241个上调，254个下调。VTN基因本身表达量极显著上调(log2FC > 24)，验证了过表达模型的成功。其他显著上调的基因包括ADM (上调4.67倍)、SPP1 (2.44倍)、CCN1 (2.10倍)等。
功能富集分析显示，DEGs在生物过程层面显著富集于细胞-细胞黏附、对钙离子的细胞响应和氨基酸跨膜转运等。细胞组分层面富集于细胞外基质、质膜复合体和囊泡运输系统。分子功能层面则涉及跨膜转运蛋白活性、肽激素结合和细胞黏附分子结合等。KEGG通路分析进一步揭示了ECM-受体相互作用、黏着斑、神经活性配体-受体相互作用和Wnt信号通路等显著富集。
GSEA分析提供了方向性见解：剪接体和氨酰-tRNA生物合成通路显著负向富集，表明转录后加工和翻译机制被广泛下调；而ECM-受体相互作用和黏着斑通路显著正向富集，与VTN增强整合素介导的黏附信号的作用一致。RT-qPCR验证了关键基因的表达变化，确认了转录组数据的可靠性。
代谢组重编程：以脂质为中心的膜重塑
代谢组学共鉴定出1733种代谢物，多变量分析显示VTN过表达组与对照组明显分离。共筛选出103个差异代谢物(53个上调，50个下调)。上调的代谢物主要包括膜脂质，如磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、醚脂和半乳糖神经酰胺(GalCer)；而下调的则包括甘油磷酸-N-花生四烯酰乙醇胺、苏糖醇等。这种特征表明，VTN-整合素轴驱动的膜构建和黏附信号增强，同时促炎脂质池减少。
差异代谢物显著富集于逆行性内源性大麻素信号、核苷酸糖的生物合成、自噬、GPI锚定生物合成以及氨基糖/核苷酸糖代谢等通路。这些通路共同指向一个支持膜周转、改善蛋白靶向和增强糖基化能力的脂质衍生信号转变。
整合的转录组-代谢组分析
整合分析识别出15条共同富集的通路，包括甘油磷脂代谢、ABC转运蛋白和逆行性内源性大麻素信号。值得注意的是，脂质相关通路在代谢组中的富集强度高于转录组，表明脂质重塑是VTN过表达的主要功能读值。在内源性大麻素通路中，转录组变化(COX3、GNG7、CNR1)与代谢组变化(如NA-GABA)相一致，提示下游代谢物NA-GABA可能作为关键的信号介质。
斯皮尔曼相关性网络分析显示，VTN作为一个中心枢纽，与多种磷脂酰胆碱和甘油中间体呈正相关。同时，一个特定的基因模块与NA-GABA呈现协同相关性。此外，ABC转运蛋白组分(如ABCG1)与N-乙酰-D-葡萄糖胺、尿苷等代谢物共现。这个网络勾勒出一个“VTN-脂质-神经活性”轴，其中VTN驱动基于脂质的膜重塑，而NA-GABA则可能通过神经-脂质耦合缓冲信号。
整合的跨物种与进化分析
系统发育分析证实VTN和ADM属于不同的旁系同源家族，两者在反刍动物(牛、羊、山羊)中形成一个高支持度的独立进化支，显示了在反刍动物模型中的高度保守性和转化相关性。染色体定位将VTN定位于绵羊11-12号染色体的中下部区域，ADM定位于15-16号染色体的中部前区。
将本研究的DEGs与公开数据集(绵羊/牛胃发育、小鼠肠道/肝脏、牛饲料效率研究)进行交叉分析，识别出保守的表达模块。例如，在高效饲料转化率的肝脏样本中，一组共同的基因(如CFD、CDKN1C、CAPS、DLL1)上调，将VTN网络与代谢性能联系起来。跨组织比较揭示了肝脏和胃肠道之间共享的胆固醇代谢和O-糖基化相关核心基因，但表达模式存在组织差异(VTN在肝脏中更高，ADM在瘤胃中更高)，暗示了VTN在协调组织特异性结构和分泌功能方面的分工。
ADM轴的单细胞分辨率解析
整合新生犊牛和成年牛瘤胃上皮的scRNA-seq数据，构建了高分辨率细胞图谱。注释了不同的上皮细胞层：基底细胞(BC1-3, 标记KRT5/14)、棘细胞(SC1-2, cg-like SC, 标记KRT10/S100A8)、颗粒细胞(GC1-3, 标记CLDN1/4)和增殖细胞(MC, 标记MKI67)，以及非上皮细胞群。成年组织以稳态的基底细胞(BC3)为主，而新生组织则含有更高比例的增殖性和分化层细胞，反映了活跃的生长和重塑。
聚焦ADM的分析显示，其表达存在明显的年龄偏倚，在新生个体中显著高于成年个体，这与新生儿上皮细胞活跃的增殖和代谢需求相符。基于ADM表达强度的分层揭示了“高”与“低”ADM表达细胞群之间的功能差异。KEGG通路富集分析表明，ADM高表达群体与分化/应激轴(包括角质化包膜形成、细胞凋亡、Foxo信号)以及代谢轴(氧化磷酸化、碳代谢)显著相关。气泡图确认了一个由年龄(新生>成年)驱动、但受ADM水平微调的共享“基础代谢网络”(碳通量、支链氨基酸降解、谷胱甘肽代谢)。
相似性分析将体外VTN过表达的转录组特征映射到体内单细胞状态。VTN过表达特征与颗粒细胞(GC)和cg-like棘细胞(cg-like SC)亚群显示出最强的正相关性，而与基底细胞(BC)特征相背离。这表明VTN驱动上皮细胞向更分化、代谢活跃的状态转变，类似于颗粒层，而非维持基底祖细胞表型。
Monocle3拟时序分析重建了细胞分化轨迹。新生细胞占据一个紧凑、平滑的早期/中期前体富集轨迹，而成年细胞则分散在晚期分支。复合时间分析揭示了一个关键转换：在早期拟时序(新生主导)，ADM与增殖和应激响应基因(如TAGLN2, GADD45A)一同达到峰值，支持祖细胞维持和代谢激活；在晚期拟时序(成年主导)，随着分化进行，ADM表达下降，与角质化和脂质成熟标记物(如GSTA1, PSAT1)呈负相关。这种时空模式表明，ADM在早期阶段作为“调节器”，支持代谢激活和祖细胞维持，随后消退以允许终末分化和屏障成熟。
讨论
细胞外基质重塑
VTN过表达导致了细胞-基质相互作用基因的改变。细胞黏附受体SDC1和血小板衍生生长因子受体PDGFRA下调，而尿激酶型纤溶酶原激活物PLAU上调，提示细胞黏附减少和生长因子信号动态改变。SPP1和TINAGL1的上调则支持了增强的组织重塑和迁移过程。VTN、SDC1、SPP1和TINAGL1等分子共同参与ECM构建、组织重塑以及整合素和生长因子通路的调节。VTN过表达还减少了ADM基因mRNA的选择性剪切位点，这可能直接刺激了ADM基因的表达。ADM作为一种多功能肽激素，其上调暗示VTN过表达可能直接或间接促进组织修复、屏障强化和局部免疫调节。
细胞代谢与适应性重编程
VTN过表达诱导上皮细胞发生以黏附和微环境适应为中心的协同转变。转录组数据显示底物摄取(如SLC2A3促进葡萄糖摄取)和合成代谢入口点(如UPP1促进尿苷补救进入核苷酸合成)上调，同时线粒体呼吸和营养代谢相关基因(如COX3、PSAT1、INSIG1/ANGPTL8)差异表达。这些变化共同支持了糖酵解和合成代谢的偏向，以适应瘤胃上皮表面潜在的低氧、剪切和酸应激环境。GSEA进一步显示ECM-受体相互作用和黏着斑显著激活，意味着整合素-FAK/Src-RhoA信号增强、黏附/铺展/迁移能力提高、细胞骨架重塑和机械转导增强；与此同时，剪接体和氨酰-tRNA生物合成被显著抑制，蛋白酶体也呈下降趋势，反映了转录后加工和翻译起始的系统性“下调”。这与“资源重新分配”模型相符：减少蛋白质生产/周转的能耗和底物负担，将能力转向ECM介导的机械适应。
代谢通路层面的变化较为温和。单细胞整合分析聚焦ADM，显示其在新生个体中表达更高，在新生细胞早期拟时序达到峰值，与增殖和代谢激活模块共调控，随后下降；在成年个体中晚期拟时序，ADM仅轻微上升，且与分化/角质化及脂质代谢成熟呈负相关。跨数据集证据也表明，ADM表达更一致地追踪脂质丰富/代谢活跃的环境，而非对VTN的直接、一致的转录反应。在细胞类型敏感性方面，GC和cg-like SC在VTN处理后最接近“VTN特征”，这与它们代谢/抗氧化程序活跃的表型和动态的ADM行为一致；相比之下，BC2则更接近对照状态，暗示其在VTN作用下可能被抑制或状态发生偏离。
综上所述，可构建一个简洁的工作模型：增强的ECM通过整合素-FAK/Src-RhoA轴驱动黏附和机械信号增加；“下调”剪接/翻译/蛋白周转以重新分配资源；温和的糖酵解偏向和调整的脂质代谢使得应激暴露的表面能够快速更新；ADM在早期/未成熟状态下上调以促进糖酵解和抗氧化，并随着角质化屏障成熟而下降；在细胞类型层面，VTN优先重编程GC和cg-like SC向代谢活跃、ECM参与的状态转变，同时使BC2偏离其对照基线，从而将“黏附力学-代谢状态-谱系进展”耦合起来。
炎症、应激响应与神经内分泌整合
GNG7和MAPK13基因显著上调。GNG7参与G蛋白偶联受体(GPCR)信号转导，其与MAPK13的共上调可能代表相互增强的通路激活，其中G蛋白信号最终通过RAS-RAF-MEK通路或其他途径导致p38 MAPK家族(包括MAPK13)的激活。MAPK13通过调节促炎细胞因子和趋化因子的产生，在炎症反应中起关键作用。两者可能共同参与NF-κB通路和炎症小体激活，并影响巨噬细胞、中性粒细胞和T细胞的募集与功能。VTN过表达还增强了免疫微环境相关基因(如CFD、TNFSF9、TREM1、GCA)的调控。
多组学整合和相关网络定义了一个上游的、以脂质为中心的状态，用于校准VTN过表达下的炎症。VTN-ECM-整合素轴的增强提升了黏附/机械感知和细胞骨架重塑，并与GPCR/p38信号串扰，启动NF-κB/炎症小体活性。网络将VTN定位在与磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱和甘油中间体紧密相连的脂质代谢枢纽，这与代谢组中PC/PE/醚脂和GalCer的增加以及花生四烯酸相关的LPE的减少相匹配。一个相反的、以NA-GABA为中心的基因簇(包含CNR1和GABA受体)则表明代谢状态与抑制性神经-脂质信号之间的耦合增强。ABC转运蛋白与甘油和核苷酸糖代谢物共现，支持协调的脂质处理和糖基化能力。总之，逆行性内源性大麻素和甘油磷脂代谢的富集，加上NA-GABA模块，提供了抑制性/缓冲性基调，平衡了具有炎症能力的信号与膜构建和黏附平台强化。
因此，净表型是“可调动但受控”的炎症：促炎脂质储备减少，抑制性脂质信号引入，而GNG7/MAPK13轴保留了细胞因子/趋化因子响应潜力，以优化屏障维持和环境适应。
代谢通路——内源性大麻素系统与自噬
VTN过表达下，差异代谢物富集于自噬、核苷酸糖生物合成、氨基糖和核苷酸糖代谢、ABC转运蛋白以及逆行性内源性大麻素信号通路，表明存在以脂质为中心的重编程，从而增强膜周转和糖基化能力，同时促进货物运输。自噬的富集反映了应激适应和PE依赖的膜重塑。鞘脂和嘧啶的变化——神经酰胺↑伴随半乳糖基转移酶减少，尿苷/脱氧尿苷↓伴随UPP1↑——支持与增殖/能量平衡相关的细胞凋亡/应激信号和尿苷补救重置。
多组学和相关网络将VTN置于与PC/PE/醚脂和GalCer紧密相连的枢纽，同时一个对立的、包含CNR1/GABA受体的NA-GABA簇表明抑制性神经-脂质耦合增强。ABC转运蛋白与甘油和核苷酸糖共变，使脂质输出与糖基化能力保持一致。在胃肠道背景下，内源性大麻素系统(CB1/CB2)调节运动、炎症、分泌和屏障功能，并可与VTN信号协同重塑基质金属蛋白酶(MMP)活性和代谢控制。甘油为PC/PE合成提供前体，为N-花生四烯酰-GABA(NA-GABA)等信号脂质提供底物，同时多余的脂质通过ABCA7/ABCG1清除以维持膜稳态。NA-GABA作为内源性大麻素组中的一种N-酰基氨基酸，整合了脂质和神经递质信号——花生四烯酸部分调节K+通道，GABA头部通过GABA受体调节Cl-流——支持p38 MAPK/离子通道相关的应激缓冲，转录线索如CNR1↑和与GABA释放相关的UNC13A强化了这种抑制性基调。
因此，VTN协调了一个以内源性大麻素为中心、ABC转运蛋白支持的程序，其中自噬和核苷酸糖生物合成维持膜更新和糖基化，补充了剪接/翻译的转录下调，以利于屏障维持和适应性重塑。
组织间串扰与反刍动物适应
VTN基因在反刍动物瘤胃和皱胃上皮中表达相对较低，而在肝脏中表达最高。ADM基因则在瘤胃和皱胃上皮中表达高于肝脏。这反映了两者的组织特异性。然而，肝脏中VTN的高表达并未引起ADM基因表达水平的显著变化。通过与瘤胃、皱胃、小肠和肝脏的公开转录组数据集比较，探索VTN和ADM影响反刍动物实际组织饲料效率的网络，可能筛选出与饲料效率相关的靶基因。
饲料效率是一个受多因素影响的综合性状。肝脏中高表达VTN和ADM基因的个体可能影响高饲料效率反刍动物的基因表达网络，其中DLL1、CFD、CDKN1C、CAPS、ARHGEF16和SAP25普遍上调，而TNNT1下调。这些基因可能作为以这两个高表达基因为轴的高饲料效率个体的特异性网络。
肝脏和胃肠道之间的共同交叉基因可能反映了VTN和ADM基因在不同组织中的核心分子调控机制。高表达VTN和ADM的个体在消化道组织中形成了一个高度协调的基因网络，通过差异基因表达调控展现出脂质代谢的优势。
在筛选出的29个基因中，脂质代谢相关基因占大多数。除了INSRR(下调)、GRAMD1B(下调)和LIPG(上调)外，其他四个脂质代谢相关基因PLCH2、SULT2B1、CELSR2和FRZB的表达模式不同。前三个在瘤胃中上调，而FRZB仅在肝脏中上调。这种脂质代谢相关基因的表达模式揭示了反刍动物组织间的代谢协同机制。INSRR、GRAMD1B和LIPG在两个组织中的协同变化代表了共享的基础脂质代谢通路，而其他四个基因则反映了组织特异性的功能差异。这种模式体现了两个关键组织的分工与合作：瘤胃负责脂质的初步消化和微生物发酵产物的加工，而肝脏则对脂质进行再加工和分配，发挥中心调控作用。INSRR和GRAMD1B的同步下调提示胰岛素信号通路和胆固醇感应功能可能减弱，LIPG的上调增强了高密度脂蛋白(HDL)的磷脂水解能力。这种表达组合可能指向一种代谢状态转变：减少胰岛素依赖的脂质合成通路，同时增强循环脂蛋白中脂质的利用，这可能是反刍动物的一种特异性适应反应。
VTN和ADM基因可能在不同组织中形成一个核心分子调控网络，通过协调这些基因的差异表达展现脂质代谢
