《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Quantitative determination of mercury in blood-based DL-cysteine-modified direct mercury analyzer method
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本文推荐一种基于DL-半胱氨酸(DL-cysteine)修饰的直接测汞仪(DMA)新方法，用于血液中汞的定量测定。该方法利用DL-半胱氨酸与汞形成稳定络合物，有效降低容器吸附和记忆效应，从而显著提升检测方法的稳定性、回收率和重复性。其检测限(LOD)为0.5 μg/L，定量限(LOQ)为1.5 μg/L，加标回收率高达99.14%-99.92%。该方法操作简便、分析快速，无需复杂样品前处理，为职业暴露人群的血汞常规监测及汞中毒临床诊断提供了高效可靠的技术支持。
1 引言
汞是一种天然富集且具有潜在毒性的工业金属，可通过饮用水、饮食摄入和工业活动释放到环境中。在环境介质中，汞以多种形式存在，包括无机元素汞、一价汞、二价汞以及甲基汞(MeHg)等有机形式。汞的毒性与其化学形态密切相关，例如，Hg2+和MeHg对含硫醇的蛋白质和酶具有更高亲和力，导致更显著的毒性效应。由于汞独特的化学性质和固有毒性，其摄入和吸收后会对人体内脏器官造成严重损害，汞中毒已成为一个备受关注的全球公共卫生问题。因此，及时、简便地检测生物样品中的汞对于临床诊断至关重要。
考虑到汞在人体内的代谢行为，选择适当的样本类型进行暴露监测对于准确反映暴露水平和相应的时间窗口至关重要。血汞水平能快速反映短期汞摄入和暴露，且其在血液中的半衰期相对较短（约2-4天），是近期（1-2周内）汞暴露的可靠指标。因此，血液样本对于急性汞中毒的诊断具有特别价值，也是评估此类近期暴露发生率和严重程度的重要参考。
目前，全血中汞的测定尚未建立统一标准。主要的血汞检测方法包括电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)、原子荧光光谱法(AFS)和原子吸收光谱法(AAS)。其中，ICP-MS灵敏度高，与液相色谱联用可实现有机汞的形态分析。然而，该方法仪器昂贵，操作相对复杂。AFS同样具有高灵敏度，但测量范围相对较窄，程序也比较复杂。因此，需要一种简单、快速、样品前处理最少的血汞测定方法。
直接测汞仪(DMA)是专门用于测量血液中总汞的仪器。其核心检测原理是通过高温热解和还原将所有形式的汞转化为气态原子汞进行分析：对于血样，仪器首先通过氧气和汞还原管将样品中的汞还原为元素汞蒸气，随后蒸气被金汞齐化管收集；该管在快速加热时释放储存的元素汞蒸气，释放的蒸气随后使用冷原子吸收光谱仪(CAAS)进行检测。DMA无需样品消解即可直接进样测定汞，该技术操作简单、分析快速，对血汞检测的样品前处理要求极低。然而，复杂基质的血样在高温热解后容易产生残留物，这些残留物倾向于附着在仪器的热解管和金汞齐收集管上。这会导致显著的记忆效应，即先前的高浓度样品污染后续的低浓度样品，导致检测结果假性升高。此外，这种残留沉积会损害金汞齐收集管的性能，导致汞原子吸附能力降低、方法检出限增加以及分析精密度受损。
L-半胱氨酸是一种天然存在的含硫醇手性α-氨基酸，是生物体内蛋白质的基本组成单元。由于其硫醇基团与重金属具有很强的配位能力，被广泛应用于重金属检测、生物化学和医学领域。先前的研究已证明其作为汞稳定剂和ICP-MS清洗剂的有效性。DL-半胱氨酸是L-半胱氨酸和D-半胱氨酸的外消旋混合物，同样容易与重金属，特别是汞形成稳定络合物。然而，由于L-半胱氨酸成本相对较高，本研究提出用更具成本效益的DL-半胱氨酸替代，以促进职业人群汞暴露的大规模生物监测。因此，本研究旨在探讨在DMA中添加DL-半胱氨酸是否能在一定程度上提升汞检测方法的分析性能。
本研究开发了一种新方法，直接在样品舟中添加DL-半胱氨酸。这种相互作用有效缓解了样品残留和记忆效应，实现了对血样中汞的灵敏、无残留、快速且用户友好的测定。通过将DL-半胱氨酸加入空白测量、校准曲线制备、回收率测定和精密度测试，以及与其他分析平台进行跨仪器验证，进行了对比实验。结果表明，添加DL-半胱氨酸显著提高了直接测汞仪的分析性能。最终，成功建立了一种新的直接测汞方法，该方法在血汞分析中表现出优异的灵敏度、重现性、回收率和抗干扰能力，为职业健康监测和汞中毒诊断的临床应用提供了一种有前景的新策略。
2 材料与方法
2.1 材料
DMA (MA-3000)购自日本仪器公司。DL-半胱氨酸（保证试剂）购自天津博仁生物技术公司。相关干扰混合物购自维业测量公司。用于汞测定的AFS购自北京泰坦仪器公司。
2.2 血样采集
使用肝素抗凝管采集静脉血样本（3-5 mL）。空白样品按照相同的采集程序制备。运输和储存时，血样和空白样品均置于清洁容器中，并在2°C–8°C下保存。
2.3 标准溶液制备
根据MA-3000的制造商说明和相关研究，使用0.1 g/L DL-半胱氨酸溶液和2%硝酸溶液（保证试剂）作为稀释基质制备汞单元素标准溶液系列1，浓度梯度为0、1、5、10、20、40、80和100 μg/L。使用2%硝酸溶液作为稀释基质制备汞单元素标准溶液系列2，浓度梯度相同。将每种标准溶液100 μL等分直接转移到样品舟中进行分析。
2.4 分析方法和步骤
样品测量前，所有样品舟均在仪器条件下预热直至获得稳定基线。分析时，将100 μL血样精确移液到预处理的样品舟中，随后加入100 μL DL-半胱氨酸溶液以确保完全覆盖样品。使用DMA在以下优化参数下进行汞测定：200°C干燥3分钟；以1.5分钟升温至650°C进行热分解并保持2分钟；650°C下还原；170°C下在金阱上进行汞齐化；900°C快速释放汞齐中的汞30秒；最后在253.7 nm处通过原子吸收进行检测。
2.5 统计分析
所有数据均使用GraphPad Prism 9.0版进行分析。连续变量的正态性使用Shapiro-Wilk检验评估。连续变量以平均值±标准差(SD)或中位数和四分位距(IQR)表示。组间连续变量的差异使用Student's t检验（正态分布数据）或Mann-Whitney U检验（非正态分布数据）进行比较。P值<0.05被认为具有统计学意义。
3 结果
3.1 空白值测定
为研究DL-半胱氨酸是否能降低残留在样品舟中的汞背景水平，本研究比较了添加与不添加100 μL DL-半胱氨酸的样品舟的背景值。比较在完成含有100 μg/L汞的100 μL血样测试并彻底清洁样品舟后进行。结果显示，添加0.1 g/L DL-半胱氨酸的样品舟基线背景值显著低于未添加组。
3.2 DL-半胱氨酸辅助DMA方法的灵敏度评估
在建立汞单元素标准曲线的实验中，设置了补充0.1 g/L半胱氨酸的实验组和不添加半胱氨酸的对照组。结果显示，对于汞单元素标准溶液系列1（含0.1 g/L半胱氨酸），0.0–100 μg/L范围内的汞质量浓度与相应的信号强度与内标元素强度的比值呈线性关系。线性回归方程为y = 0.0238x+0.0062，相关系数(R2)为0.9996。检出限(LOD)为0.5 μg/L，定量限(LOQ)为1.5 μg/L。对于汞单元素标准溶液系列2（不含DL-半胱氨酸）：0.0–100 μg/L范围内的汞质量浓度也显示出与相应信号比的线性关系。线性回归方程为Y=0.000056X + 0.000002，相关系数(R2)为0.9980。检出限(LOD)为0.9 μg/L，定量限(LOQ)为1.7 μg/L。
3.3 重复性评估
为评估精密度，平行制备三种浓度（20.0、50.0和100.0 μg/L）的标准溶液，每个浓度在同一批次内分析六个重复。进行了一项对比实验，其中一组重复在样品舟中添加100 μL 0.1 g/L DL-半胱氨酸溶液，另一组则不处理。所有测定均严格参考同一校准曲线。结果表明，在所有浓度水平下，DL-半胱氨酸处理组的相对标准偏差(RSD)始终低于对照组。这表明DL-半胱氨酸发挥了一定的稳定作用。
3.4 回收率评估
通过加标回收实验评估方法的准确性。选择不同浓度水平的样品，在三个浓度梯度下进行加标回收测定。结果显示，对于不同浓度的样品，在样品舟中添加DL-半胱氨酸的组的加标回收率在99.14%至99.92%之间，而未添加组的回收率仅为92.63%–97.58%。这表明在样品舟中添加DL-半胱氨酸可显著提高目标物质的回收率。
3.5 甲基汞测定性能分析
本研究旨在评估DMA是否能完全热分解甲基汞(MeHg)，将其还原为元素汞蒸气，并释放收集的元素汞用于随后的冷蒸气原子吸收光谱法定量分析。通过用0.1 g/L DL-半胱氨酸重量稀释甲基汞标准溶液制备甲基汞标准曲线，得到0、1、5、10、20、40、80和100 μg/L的浓度系列。通过将标准系列得到的信号值与其相应的汞浓度相关联来绘制校准曲线。在优化的实验条件下定量溶液中的汞，并根据标准系列信号响应与浓度关系构建校准曲线。线性回归方程为y = 0.0216x+0.0009，相关系数(R2)高达0.9999。此外，在样品舟中添加0.1 g/L DL-半胱氨酸后，甲基汞检测的加标回收率在91.11%–98.97%之间。
3.6 乙基汞测定性能分析
建立了乙基汞(EtHg)的校准曲线。用0.1 g/L DL-半胱氨酸重量稀释乙基汞标准溶液，制备浓度为0、1、5、10、20、40、80和100 μg/L的标准系列。通过绘制从标准溶液获得的信号值与其相应汞浓度的关系来绘制校准曲线。在优化的实验条件下测定测试溶液中的汞含量，校准曲线（信号响应与浓度）的线性回归方程为y = 0.0188x+0.0008，相关系数(R2)为0.9998。此外，在样品舟中添加0.1 g/L DL-半胱氨酸后，乙基汞检测的加标回收率在91.40%–97.65%之间。
3.7 总汞性能分析
在既定条件下测定溶液中的汞，并使用从标准浓度系列获得的信号值与相应汞浓度的关系绘制校准曲线。在相同条件下，同时测量总汞、甲基汞和乙基汞。三者之间的相关性如表所示。如图所示，在相同的校准条件下，总汞、甲基汞和乙基汞的结果表现出良好的一致性。
3.8 干扰分析
配制20 μg/L汞应用溶液，并按本方法测量。为研究DL-半胱氨酸是否能减轻不同元素对目标检测系统的干扰效应，本实验分为两大组：补充DL-半胱氨酸的实验组和未补充DL-半胱氨酸的对照组。在两组中，分别设置一个无干扰对照亚组和五个单元素干扰亚组（硒(Se)、铅(Pb)、砷(As)、镉(Cd)和锰(Mn)；多元素混合物包括铜、锌、铁、钙、镁）。如表所示，测试结果的偏差小于10%，表明在100 μg/L水平下，Se、Pb、As、Cd、Mn等的浓度对测试结果无干扰。如下表所示，样品舟中是否存在DL-半胱氨酸对干扰抵抗测试的结果没有实质影响。
3.9 样品稳定性评估
使用同一血样制备两组测试溶液：一组在样品舟中添加0.1 g/L DL-半胱氨酸，另一组不添加。每组进行十次平行测量分析。计算平均浓度和相对标准偏差(RSD)。在实际样品基质中，添加DL-半胱氨酸的组的RSD低于未添加DL-半胱氨酸的组，表明该方法稳健，适用于真实样品的准确定量分析。
为研究样品在样品舟中的停留时间是否影响样品结果，本研究选择了相同浓度水平的血样。将同一血样分为两组，每组包含20个子样本。在一组中，样品舟中添加DL-半胱氨酸，另一组则不添加。按进样顺序在样品舟中依次分析样品，以研究样品舟中的停留时间是否影响实验结果。结果显示，对于相同浓度的样品，添加DL-半胱氨酸的样品的降解率为5.61%，而未添加DL-半胱氨酸的样品降解率为8.83%。这表明添加DL-半胱氨酸在一定程度上降低了降解率。
3.10 与原子荧光光谱法(AFS)的比较
为比较0.1 g/L DL-半胱氨酸修饰的DMA与AFS对同一样品的性能，使用两种方法进行分析。结果显示，修饰后的DMA方法的检测值略高于AFS。这可能是由于消除了样品消解（减少了汞损失）以及DL-半胱氨酸的残留缓解效应，进一步减少了检测过程中的汞损失。
3.11 实际应用
2025年，本研究开发的DMA用于分析323份生物样本。共有124名个体的血汞水平超过正常阈值，与预期的背景暴露情况一致。
4 讨论
汞是一种具有高毒性和持久性的全球性污染物。它容易在生物体内生物累积，对人类健康和环境构成严重威胁，特别是对于有汞暴露的职业人群。因此，快速、方便、准确地测定血样中的汞对于汞相关疾病的诊断和治疗至关重要。中国贵州省汞矿储量丰富，并开展大规模的汞开采和加工活动。因此，该地区某些职业群体长期暴露于有害的汞污染环境。因此，开发一种高效、简单、快速的检测方法对本研究尤为重要。
DMA无需样品消解即可直接测定汞。该技术操作简单、分析快速，对血汞检测的样品前处理要求极低。DL-半胱氨酸可与重金属，特别是汞形成稳定络合物，是一种有效的汞稳定剂。
空白值实验结果表明，添加DL-半胱氨酸显著降低了检测系统的背景信号。这一现象证实了其在减轻分析过程中汞的吸附以及抑制汞残留在样品舟表面的有效性。基于此，可以推断DL-半胱氨酸改善残留问题的作用机制主要归因于其稳定汞形态和抑制汞损失的能力。DL-半胱氨酸分子可与汞离子形成稳定络合物，这种结构有效防止了汞因吸附在容器壁、挥发或与样品基质共沉淀而造成的损失。
在建立标准曲线过程中，含有DL-半胱氨酸的标准溶液表现出更优的分析响应，表明DL-半胱氨酸发挥了稳定和保护作用。根据相关研究，许多分析人员使用金、L-半胱氨酸、磷酸氢二钠、溴化钾、硫化钠、二硫苏糖醇、乙二胺四乙酸和2-巯基乙醇等化合物作为汞的稳定剂以提升分析性能。在我们的研究中，该方法充分证明DL-半胱氨酸可以达到与上述物质相当的稳定效果。
重复性、稳定性和回收率的验证实验进一步证实，补充DL-半胱氨酸的实验组在检测结果中表现出更优的重复性和稳定性。我们推测其作用机制源于DL-半胱氨酸与汞形成稳定络合物的能力，从而降低了汞在玻璃、塑料容器和仪器进样管表面的固有吸附倾向。这进而在一定程度上缓解了吸附效应和记忆效应，确保了连续批次分析的可靠性。
在有机汞的实验分析中，添加DL-半胱氨酸后，甲基汞和乙基汞的检测均表现出优异的分析性能，与元素汞相比未观察到显著差异。在与汞中毒相关的研究中，有机汞被认为是中毒事件的主要贡献者。基于此，本研究重点探讨了DMA是否能在无需复杂前处理的情况下，将样品中的有机汞完全转化为元素汞蒸气，从而实现总汞含量的准确测定。实验结果证实，在DMA检测系统内，有机汞完全热分解并被还原为元素汞蒸气，检测结果与其他汞形态（如无机汞）的结果一致。这一发现充分验证了本研究建立的DL-半胱氨酸辅助DMA方法在血汞分析中的准确性和可靠性，确保该方法能够真实反映血样中的总汞水平。然而，该方法缺乏汞形态分析能力，无法识别或定量样品中有机汞和无机汞等特定形态。因此，未来的研究可以聚焦于优化汞形态检测技术，以进一步完善血汞分析体系，从而为汞中毒的准确诊断和病因分析提供更强大的技术支持。
DMA固有的技术优势，如检测时间短、操作简单，进一步增强了其在血汞分析中的实用性，并为大规模样本的快速检测提供了优秀的方法。该方法无需传统的样品前处理，如微波消解或湿法消解。这一特点不仅降低了对高技能操作人员的要求，使其非常适合社区医院等基层实验室。血样可直接引入仪器，省去了酸消解、酸蒸发和体积调节等繁琐步骤。每个样品从进样到结果输出的总分析时间仅为8-10分钟。相比之下，CVAAS和AFS通常需要约30分钟（包括前处理），而ICP-MS需要约20分钟。这种高通量特性使其每天能够分析数百个血样，非常适合职业健康监测和临床批次检测等大规模筛查场景。
5 结论
本研究建立了一种基于DL-半胱氨酸的DMA测定血汞的方法。DL-半胱氨酸在三个关键阶段被引入：在背景测量期间将其加入空白溶液；在制备标准曲线时用作汞稳定剂；在精密度、回收率和血样测试实验中加入样品舟。结果表明，加入DL-半胱氨酸的方法检出限(MDL)为0.5 μg/L，定量限(LOQ)为1.5 μg/L。方法精密度在0.73%至3.28%之间，加标回收率在99.14%至99.92%之间。在实际样品分析中，该方法表现出稳健的重复性和稳定性。通过DL-半胱氨酸的稳定和络合作用，有效提高了检测方法的准确度、精密度、重复性和稳定性，所有分析指标均满足血汞定量分析的要求。此外，本研究证实DMA能在无需复杂样品前处理的情况下，将样品中的有机汞完全转化为元素汞蒸气，从而确保了总汞测定的准确性和可靠性。该方法具有高效、方便、安全、低成本的优点，适用于职业暴露人群的血汞水平常规监测，并可为职业健康保护以及汞中毒的早期筛查和临床诊断提供可靠的技术支持。
