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本文为神经科学领域提供了一项标准化实验方案，旨在解决从高龄动物获取高质量急性脑切片以研究突触功能与可塑性的技术挑战。该方法采用经心氯化胆碱灌流，有效保持了年轻与衰老小鼠内侧前额叶皮层神经元的细胞结构完整性与功能活性，并首次在同一切片上成功诱导并量化了年龄依赖性的化学性长时程增强效应差异。本方案为在衰老大脑中系统性研究突触传递、可塑性及其在神经退行性疾病中的作用提供了可靠、可重复的技术框架。
引言：评估衰老大脑突触可塑性的挑战与需求
衰老是神经退行性疾病的主要风险因素，伴随着神经元网络功能的深刻变化，最终导致认知、感觉或运动功能衰退。神经元及其突触在结构、功能和分子水平上适应内外刺激的能力，是学习、记忆和高级认知功能的基础。因此，在衰老大脑中，对神经元及其调整突触特性的能力进行功能和结构评估，对于深入理解神经病理机制和年龄相关的认知衰退至关重要。
尽管离体急性脑切片制备已被广泛应用于研究神经元的电生理特性，但大多数实验集中在年轻成年小鼠，而对衰老大脑中神经元网络和突触传递的系统性研究仍然匮乏。由于脑组织成分的年龄相关变化，如髓鞘化程度增加导致硬度升高，以及对缺氧和渗透压应激的脆弱性增强，从高龄动物制备适用于单细胞研究的急性切片构成了重大的实验挑战。为减少切片过程中由Na+诱导的兴奋毒性，已提出了多种使用基于N-甲基-D-葡糖胺(NMDG)、蔗糖或胆碱的溶液的实验方案。其中，基于NMDG和基于胆碱的溶液在老年动物中表现出优于蔗糖的特性。与NMDG溶液相比，基于氯化胆碱的方案提供了一种技术上更直接、易于在标准电生理程序中实施的替代方案。
材料与设备
本文详细列举了制备过程中所需的全部试剂、溶液配方、实验仪器、设备和软件。关键试剂包括氯化胆碱、腺苷5‘-三磷酸镁盐、DAPI、毛喉素等。溶液配制方面，核心包括用于灌流和切片的氯化胆碱溶液、用于恢复和记录的人工脑脊液，以及用于膜片钳记录的细胞内液。设备涵盖了从精细解剖工具、恒冷切片机，到膜片钳放大器、数据采集系统、共聚焦显微镜等一系列专业仪器。为确保结果可重复，文章强调了使用去离子水配制溶液、溶液储存条件与有效期等关键细节。
方法与实验步骤
伦理声明：所有实验程序均符合德国动物福利法规，并获得汉诺威医学院相关机构的批准。本研究使用雌性C57BL/6J小鼠，分为两个年龄组。
概述分步方案：整个过程分为四个主要阶段，并配有详细的时间预估：准备阶段（约1小时）、灌流与脑分离（约10分钟）、切片程序与组织恢复（约1小时恢复）、可塑性评估（约1.5小时/切片）。
急性切片制备
- 1.
准备：配制氯化胆碱溶液和人工脑脊液(aCSF)。制备用于调整内侧前额叶皮层切角的1.7%琼脂糖斜坡。设置恒冷切片机，清洗切片室和刀片，并将切片参数设定为：速度0.1，振幅1.6，切片厚度350微米。将氯化胆碱溶液置于冰上并持续通入碳合气。在切片机旁预热水浴，并将恢复室置于其中，用预热的aCSF平衡。准备好所有手术器械和溶液。
- 2.
经心灌流：用异氟烷麻醉小鼠直至窒息。将小鼠固定在手术台，暴露胸腔，在右心房或肝脏做切口以引流血液。将蝴蝶针插入左心室，以约250微升/秒的流速缓慢灌注约12-15毫升预冷的氯化胆碱溶液。成功灌流的标志是肝脏颜色由深红转为苍白。灌流后快速断头并立即进行脑组织分离。
- 3.
组织提取与急性切片程序：在预冷的金属块上进行后续操作。仔细打开颅骨，用刮铲轻柔取出大脑，并将其置于约20度角的琼脂糖斜坡上。在延髓与脊髓连接处前方做一个横切，形成一个平整的后表面。将此切面用超能胶固定在样品台上，并在大脑腹侧用琼脂糖块提供额外支撑。将样品台置于切片机中，在持续通氧的冰冷氯化胆碱溶液中，以350微米厚度进行冠状切片。切片完成后，用宽口径玻璃移液管将切片转移至预热至35°C的aCSF恢复室中，恢复30分钟。随后，将切片转移至室温下的aCSF保存室中，静置至少30分钟以上，方可进行电生理记录。
电生理学 – 可塑性方案
- 1.
记录准备：将切片转移至电生理记录槽，避免剪切应力。持续灌注预热（35°C）并氧化的aCSF。在红外微分干涉相差镜下识别并选择神经元。
- 2.
全细胞膜片钳记录：使用内含生物胞素的K-葡糖酸盐电极，在电压钳模式下，于-70mV保持电位记录自发兴奋性突触后电流(sEPSC)。记录前需监测系列电阻，排除不稳定或质量不佳的记录。随后，可在电流钳模式下评估神经元的被动膜特性（静息膜电位、输入电阻）和兴奋性。
- 3.
化学性长时程增强(cLTP)诱导：在每张切片中记录2-3个颗粒上层(L2/3)锥体神经元的基线sEPSC。随后，在记录槽中灌入含10微摩尔毛喉素的aCSF，持续10分钟，之后洗脱至少10分钟。最后，在同一张切片中记录另外2-3个神经元洗脱后的sEPSC，以便进行切片内的配对比较。
- 4.
记录后处理：记录完成后，将切片固定在多聚甲醛中，以备后续染色。
事后可视化
固定后的切片经过漂洗、封闭后，用链霉亲和素Alexa Fluor 647孵育，以显示被记录的生物胞素填充的神经元，并用DAPI染色细胞核以显示细胞构筑。最后，将切片封片并在共聚焦显微镜下成像。
定量与统计学
电生理数据使用pClamp软件分析sEPSC特性。静息膜电位在计算液体接界电位后进行校正。数据使用GraphPad Prism进行统计分析，采用曼-惠特尼检验比较“处理前”与“处理后”的组间差异，并使用配对威尔科克森符号秩检验进行切片内的配对比较。p值小于0.05被认为具有统计学显著性。
故障排除
文章针对实验过程中可能遇到的七个常见问题提供了详细的解决方案和原因分析，包括：灌流不充分、组织切割不当或粘连、切片表面出现死亡神经元、膜片不稳定、记录过程中膜孔反复封闭、共聚焦图像模糊、以及神经元顶树突被截断。每个问题都给出了具体的检查步骤和调整建议，是方案可靠实施的重要保障。
结果
年轻与衰老小鼠的切片呈现出完整的皮层分层以及树突与突触形态
对生物胞素填充的神经元进行事后可视化与DAPI染色显示，在年轻和衰老两个年龄组中，所记录切片的内侧前额叶皮层均保持了完整的皮层分层。神经元的基底树突和顶树突未被切片过程截断，展现出高度分支的树突结构。对树突片段的高分辨率成像显示，年轻和衰老小鼠神经元上的树突棘（兴奋性突触的结构基础）的形态和多样性均得到了保留，年龄组间没有明显的定性差异。这些观察表明，本方案即使在衰老小鼠中也保持了颗粒上层内侧前额叶皮层神经元的结构完整性，为在结构完好的神经元中评估突触功能和可塑性提供了合适框架。
颗粒上层锥体神经元在年轻与衰老小鼠切片中表现出年龄特异性的兴奋性突触可塑性表达
为了测试年轻与衰老小鼠内侧前额叶皮层颗粒上层锥体神经元在兴奋性突触可塑性表达上是否存在差异，我们采用了基于毛喉素的化学性长时程增强(cLTP)方案。
在年轻成年动物中，毛喉素处理导致兴奋性神经传递显著增强。当比较所有动物的神经元时，毛喉素暴露后sEPSC的半峰宽和面积显著增加。对同一切片内记录的神经元平均值进行配对比较进一步揭示，cLTP诱导后sEPSC频率显著增加。
在衰老小鼠中，当比较所有动物处理前后的神经元时，毛喉素应用导致sEPSC频率显著增加，而sEPSC的幅度、半峰宽和面积保持不变。这种频率特异性效应得到了同一切片内神经元配对比较的证实。
这些数据表明，年轻和衰老动物的内侧前额叶皮层颗粒上层锥体神经元都保留了响应毛喉素诱导cLTP而调整兴奋性神经传递的能力。然而，突触变化模式随年龄而变化：在年轻动物中，可塑性表现为sEPSC频率的增加以及sEPSC动力学参数（半峰宽和面积）的改变；而在衰老动物中，则主要反映为事件频率的增加。
被动膜特性在毛喉素洗入后保持不变
为了确定这些突触变化是否伴随着被动膜特性的改变，我们记录了输入-输出曲线，并测量了记录神经元在毛喉素处理前后的静息膜电位和输入电阻。在年轻或衰老动物的切片中，这些参数在处理前后均未显示显著差异。因此得出结论，在两个年龄组中，颗粒上层内侧前额叶神经元兴奋性神经传递的毛喉素诱导cLTP发生，而未检测到被动膜特性的变化。
讨论
本研究采用标准化的氯化胆碱灌流方案，成功获得了年轻和衰老小鼠的内侧前额叶皮层急性切片。利用该方案，我们保持了衰老组织中神经元的结构完整性，包括作为兴奋性突触结构基础的树突棘。全细胞膜片钳记录揭示了两个年龄组中颗粒上层锥体神经元在毛喉素诱导下的兴奋性神经传递增强。这种效应体现在sEPSC频率的增加，而内在膜特性保持不变。同时，我们发现了sEPSC半峰宽和面积的年龄依赖性差异，表明可塑性表达的模式在年轻和衰老动物之间存在不同。这些发现与越来越多的文献一致，表明衰老可以改变突触可塑性的幅度和表达谱。
离体急性脑切片是神经科学中一种成熟的研究工具，但其成功高度依赖于快速处理以及切割和恢复溶液的离子组成和温度。与年轻组织相比，老年动物的组织更为脆弱，对缺氧和渗透压应激的敏感性增加，硬度增强使切割过程复杂化。此外，切片过程中Na+诱导的去极化可引发兴奋毒性和神经元变性，这在衰老大脑中更为明显。为减轻这些年龄相关的脆弱性，我们在切片前进行了冰冷氯化胆碱溶液的经心灌流。灌流充分氧化的冰冷保护液已被证明可以通过最大限度地减少缺血、减少氧化应激并促进切割时减少组织撕裂来提高组织活力。值得注意的是，我们没有在年轻或衰老大脑的制备和记录过程中直接量化氧化应激或应用额外的抗氧化措施。虽然抗氧化剂补充可能在某些实验设置中改善切片质量，但此处未观察到明显的切片质量限制。
本方案的一个关键决定因素是切片前的保护液灌流。使用该方案，我们可靠地获得了来自衰老小鼠的可行内侧前额叶皮层切片，这些切片显示出完整的皮层分层和保留的树突结构，从而能够分析年龄依赖性的结构-功能关系。我们认为此方案是一个强大的选择，可以在常规急性切片流程中以更短的准备时间和直接的操作实施。
神经退行性疾病常伴随着大脑对可塑性诱导刺激的反应能力受损。因此，理解突触可塑性在衰老过程中如何表达和调节具有重要意义。全细胞膜片钳记录为在单神经元水平直接获取突触事件提供了途径。本研究中，我们使用基于毛喉素的方案诱导化学性LTP，以探测结构完好的颗粒上层锥体神经元的兴奋性突触可塑性。年轻和衰老成年小鼠的神经元均显示出毛喉素诱导的sEPSC频率增加，表明内侧前额叶的兴奋性突触在跨年龄阶段保留了基本的、独立于活动的cAMP驱动的增强能力。值得注意的是，在年轻成年小鼠中，毛喉素处理还增加了sEPSC的半峰宽和面积，而这些参数在衰老小鼠中保持不变。这种模式表明可塑性实现的机制存在年龄依赖性差异。毛喉素已知可激活腺苷酸环化酶并增加细胞内cAMP水平，从而通过增加囊泡的即刻可释放库来增强突触前释放概率。在突触后，cAMP依赖性信号传导可促进AMPA受体亚基的磷酸化及其插入突触后致密区，导致突触增强。此外，cAMP依赖性级联反应可参与mTOR依赖性的可塑性相关蛋白合成，支持更持久的突触修饰形式。在此框架内，观察到的sEPSC频率增加可能主要反映了两个年龄组都保留的突触前变化，而年轻小鼠中sEPSC半峰宽和面积的额外变化可能表明突触后贡献更为显著。这些动力学和整合参数通常对突触后受体动力学、受体可用性以及受体募集或聚集的改变敏感。尽管我们的数据没有直接剖析突触前和突触后机制，但它们与以下观点一致：cAMP依赖性可塑性的突触后成分在衰老的颗粒上层锥体神经元中可能被选择性地减弱或改变。
尽管本方法具有优势，但必须考虑急性切片制备和离体可塑性范式的几个局限性。即使组织活性和分层得以保留，切片过程也不可避免地会造成机械创伤和急性胶质细胞反应，这可能影响后续的可塑性相关信号。此外，在切片过程中，长程皮层和丘脑皮层投射被切断，导致局部回路的孤立和生理性输入模式的丧失。在解释年轻和衰老大脑的离体回路水平发现时，特别是在推断到在体情况时，应考虑这些网络水平的变化。尽管如此，急性切片制备为结合高分辨率结构分析和单细胞水平的精确电生理测量提供了独特的机会。在衰老和神经退行性病变的背景下，本文提出的改进工作流程能够在结构保留的衰老新皮质神经元中对突触传递和可塑性进行可重复的研究，从而为剖析导致年龄相关认知衰退和疾病相关网络功能障碍的细胞机制提供了一个有价值的平台。
