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这项研究聚焦于肌萎缩侧索硬化症（ALS）的致病机制，鉴定了一个新型的KIF5A基因内含子变异体c.2993-6C > A。研究者利用携带该变异体的诱导多能干细胞（iPSC）模型，证明该变异导致KIF5A基因第27外显子跳跃，产生缺失外显子的蛋白（KIF5A ΔExon27）。功能实验揭示，该变异蛋白破坏了与关键货物剪接因子脯氨酸-谷氨酰胺富集蛋白（SFPQ）的轴突相互作用，并在应激条件下诱发了TDP-43蛋白病理。研究为KIF5A相关ALS的TDP-43依赖性发病机制提供了新见解。
引言背景
肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种致命的神经退行性疾病，以上、下运动神经元（MNs）的进行性丧失为特征。尽管大多数ALS病例是散发性的，但约10%与特定的致病基因变异有关。近年来，全基因组关联研究（GWAS）揭示了驱动蛋白家族成员5A（KIF5A）基因的变异是ALS的一个遗传风险因素。大多数ALS相关的KIF5A变异聚集在其C端尾部第27外显子的剪接位点，已知会导致第27外显子完全跳跃，产生C末端区域改变的突变蛋白（KIF5A ΔExon27）。本研究旨在探讨一个在ALS家族中发现的新型KIF5A内含子变异体rs1057522322（c.2993-6C > A）的功能后果。
新型KIF5A变异在ALS家族中的鉴定与功能研究
新型KIF5A变异在ALS家族中的鉴定
研究者在一个具有ALS家族史的先证者中，通过全基因组测序鉴定出一个位于第26内含子的杂合KIF5A变异，rs1057522322（c.2993-6C > A）。该变异位于第27外显子上游6个核苷酸处，此前被归类为意义不明确的变异。通过对家族成员的Sanger测序验证，发现该变异存在于所有患病亲属中，但同时也存在于未受影响的家庭成员中，表明该变异具有不完全外显率，且发病年龄存在很大差异，提示可能存在其他遗传或表观遗传修饰因子。
内含子变异c.2993-6C > A改变KIF5A第27外显子剪接
为了验证该内含子变异是否影响剪接，研究者从携带和不携带该变异的同胞中获取外周血单核细胞，重编程为诱导多能干细胞（iPSCs），并分化为神经前体细胞（NPCs）。对NPCs的RNA进行逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析，证实c.2993-6C > A变异诱导了KIF5A第27外显子的跳跃，产生了一个外显子缺失的转录本，而在对照细胞系中该转录本几乎不存在。有趣的是，尽管SpliceAI计算预测该变异对剪接影响不大，但实验数据推翻了这一预测，强调了实验验证的重要性。
变异KIF5A蛋白在iPSC源性运动神经元中与SFPQ共定位失败
剪接因子脯氨酸-谷氨酰胺富集蛋白（SFPQ）是KIF5A/KLC1马达复合体特异性运输的货物。研究者利用iPSC分化的运动神经元模型，探究KIF5A ΔExon27蛋白运输SFPQ的能力。虽然细胞分化为MN的效率在不同细胞系间无差异，但免疫荧光染色结果显示，在轴突中，参考KIF5A能有效与SFPQ共定位，而表达KIF5A ΔExon27蛋白的细胞，即使存在功能正常的参考KIF5A拷贝，与SFPQ的轴突相互作用也显著受损。这表明变异蛋白损害了KIF5A介导的货物运输。
生理条件下KIF5A变异不影响TDP-43定位
由于细胞质TDP-43聚集是97%ALS患者的尸检病理标志，研究者检查了携带KIF5A变异的MN中是否自发形成TDP-43阳性包涵体。在生理条件下，无论是对照KIF5A还是表达KIF5A ΔExon27的细胞，TDP-43都主要定位在细胞核内。同样，在细胞质中未检测到磷酸化TDP-43（pTDP-43）的聚集，表明在稳态下，该变异并未直接引发典型的TDP-43蛋白病。
急性氧化应激在变异运动神经元中触发TDP-43病理
为了模拟ALS病程中可能存在的压力条件，研究者用0.5 mM亚砷酸钠处理MN 90分钟，诱导急性氧化应激。尽管在对照组和变异组的MN中，应激颗粒标志物TIAR均能形成应激颗粒，但TDP-43仅被招募到少数TIAR阳性颗粒中。更重要的是，在应激条件下，变异MN中的TDP-43在细胞核中的表达减少，并更多地错误定位到细胞质中。同时，细胞质pTDP-43的表达水平在两组中均增加，但与对照组相比，变异MN显示出数量更多、尺寸更大的pTDP-43斑块。这表明，虽然KIF5A变异本身在生理条件下不足以诱发TDP-43病理，但在应激条件下，它会促进TDP-43的细胞质错误定位、磷酸化和聚集，加剧病理过程。
讨论与结论
本研究证实了新型KIF5A内含子变异c.2993-6C > A是ALS的一个风险因素，其通过诱导第27外显子跳跃产生功能异常的KIF5A ΔExon27蛋白。该变异蛋白几乎完全破坏了KIF5A对SFPQ的轴突运输，这可能是因为KIF5A ΔExon27与参考KIF5A形成结构缺陷的二聚体或寡聚体，或者通过竞争性抑制功能性的KIF5A马达，导致可用于正常货物运输的KIF5A减少。值得注意的是，ALS相关的KIF5A变异导致KIF5A功能亢进，运动性增强，这可能导致细胞内功能性KIF5A的快速耗竭，并可能自身形成聚集体，使细胞在压力下更为脆弱。
在TDP-43病理方面，研究发现，仅遗传易感性（即存在KIF5A变异）不足以引发疾病，而是需要“二次打击”，如衰老或环境压力（如氧化应激），才能触发TDP-43的细胞质错误定位和聚集。这支持了ALS发病的多因素模型。研究也存在一些局限，例如，由于缺乏能区分参考和变异KIF5A蛋白的商业抗体，无法精确解析不同二聚体构型与SFPQ的特异性相互作用。此外，SFPQ运输缺陷的下游生物学后果也有待进一步探索。
综上所述，这项研究揭示了ALS相关KIF5A变异通过损害轴突运输并最终在应激下协同引发TDP-43病理的新机制，为理解轴突运输缺陷与RNA代谢紊乱在ALS中的协同致病作用提供了新的视角。
