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本研究报道了一个与脑室周围结节状灰质异位症（PNH）相关的全新FLNA剪接变异体（c.4599-2A>G），通过多种分子技术（WES、ddPCR、RNA-seq、minigene）揭示了其导致双重异常转录本（10bp缺失与28号外显子完全跳过）的分子机制，并首次在父亲中证实了组织特异性体细胞嵌合现象。该研究扩展了PNH的表型与基因谱，为理解FLNA相关疾病的病理机制、嵌合遗传模式及遗传咨询提供了重要证据。
引言
脑室周围结节状灰质异位症（PNH）是一种神经元迁移障碍，特征为神经元未能正确迁移至大脑皮质，而异常定位于脑室周围。其主要临床表现是癫痫，常伴有智力障碍。PNH具有遗传异质性，与多个基因变异相关，其中FLNA基因的致病性变异是最常见的遗传原因。4
FLNA基因位于Xq28，编码一个280kDa的肌动蛋白结合蛋白（filamin A）。该蛋白的N端含有肌动蛋白结合结构域（ABD），并在细胞骨架构建、细胞形态维持、迁移和机械力传导中起关键作用。FLNA基因以X连锁方式遗传，女性患者占主导，半合子男性患者常发生宫内或出生后早期死亡，仅远端截短变异或嵌合体变异的男性有存活报告。10,11本研究描述了一个由新发FLNA剪接位点变异（c.4599-2A > G）导致的中国PNH家系的临床和遗传学特征。
方法
分子遗传学分析
从外周血样本中提取基因组DNA。使用SureSelect Human All Exon试剂盒V6在Illumina Novaseq 6000平台上进行全外显子组测序（WES）。序列读取结果通过BWA比对工具映射到人类参考基因组（UCSC hg19）。使用SAMtools等软件分析SNVs和插入缺失。变异筛选和注释参考了OMIM、ClinVar、HGMD等数据库，并根据美国医学遗传学与基因组学学会指南进行分类。使用Polyphen-2、SIFT和MutationTaster预测变异致病性。
数字PCR
从先证者父亲的外周血、精液、口腔粘膜细胞和毛囊中提取DNA。使用Bio-Rad QX200微滴数字PCR（ddPCR）系统进行检测。反应体系包含ddPCR Supermix、特异性引物、VIC和FAM标记的MGB探针及DNA模板。通过液滴生成器乳化后进行热循环，使用QX200液滴阅读器定量荧光信号，并用QuantaSoft软件分析数据，以量化不同组织中的变异等位基因频率。
RNA分析
从外周血中提取总RNA，并使用PrimeScript FAST RT试剂盒合成cDNA。通过PCR扩增cDNA，琼脂糖凝胶电泳分离产物，纯化后进行Sanger测序。将纯化的PCR产物连接到pMD18-T载体，转化至感受态大肠杆菌DH5α细胞，通过菌落PCR筛选单克隆，并对阳性克隆进行Sanger测序，以分析转录本。
Minigene剪接分析
该分析由武汉百易生物科技有限公司完成。设计嵌套引物扩增FLNA基因跨越外显子27-29的基因组区域。将PCR扩增片段克隆到minigene载体pcDNA3.1中。将重组载体转染至HeLa和293T细胞，转染48小时后使用TRIzol试剂提取总RNA。最后，通过RNA-seq和Sanger测序分析重组载体的剪接情况。
结果
临床表现
本研究描述的中国汉族家系来自中国福建省厦门市。先证者是一名7岁女童，足月（妊娠37周）顺产，无围产期窒息史。出生体重2.0公斤，身长42厘米。出生后第3天的脑部磁共振成像（MRI）显示胼胝体发育不全、双侧室管膜下灰质异位和枕部蛛网膜囊肿。7岁时的随访颅脑MRI证实了室管膜下灰质异位的存在。先证者的染色体核型为46， XX。因先证者身材矮小，在5岁时进行了基因检测。先证者的母亲在第一次妊娠23周时进行产前超声检查，发现胎儿脑部异常。随后的胎儿MRI显示双侧脑室壁信号异常，提示可能存在灰质异位、胼胝体部分发育不全、侧脑室后角扩张和小脑延髓池扩大。此外，还注意到胎盘异常。由于这些发现，妊娠被终止。未对胎儿进行基因检测。母亲在孕早期无感染、发热、用药、辐射暴露或阴道出血史。先证者的父亲，一名36岁男性，身高171厘米，体重50公斤。父亲智力正常，颅脑MRI未发现异常。
WES分析
WES在先证者的FLNA基因内含子27的3'剪接受体处鉴定出一个杂合变异c.4599-2A > G。Sanger测序证实了先证者和父亲外周血中存在此变异，先证者为杂合状态，父亲为半合子嵌合状态，而母亲为野生型。该变异在人群数据库中等位基因频率<0.0005，根据美国医学遗传学与基因组学学会变异分类指南，被归类为可能致病（PVS1 + PM2）。该变异之前未见报道，在HGMD、ClinVar、dbSNP、1000G、ExAC、ESP6500或其他SNP数据库中均未发现。
数字PCR
ddPCR分析显示，先证者父亲不同组织中FLNA c.4599-2A > G变异嵌合水平存在显著差异。变异等位基因频率在外周血中为65.98%，在精液中为60.38%，在口腔粘膜细胞中为28.95%。毛囊样本未分析到合适的候选细胞。这些发现为先证者父亲存在体细胞嵌合现象提供了直接证据。
RNA分析
对先证者及其父母提取的RNA进行PCR分析，所有样本均显示单一条件。然而，Sanger测序显示母亲和先证者为单峰，与正常剪接转录本（522 bp，命名为亚型a）的预期大小一致。相比之下，父亲的测序结果显示双峰，表明存在两种不同的剪接产物（亚型a和b）。对父亲凝胶纯化的cDNA PCR产物进行TA克隆以进一步表征这些转录本。在筛选的30个单细菌克隆中，对7个克隆的Sanger测序鉴定出6个克隆含有正常剪接转录本（亚型a），1个克隆携带异常剪接转录本（亚型b）。正常剪接模式（亚型a）包含外显子26（171 bp）—外显子27（124 bp）—外显子28（157 bp）—外显子29（190 bp）。相比之下，异常剪接转录本（亚型b）在外显子28左侧有10-bp的缺失，导致剪接模式改变为：外显子26（171 bp）—外显子27（124 bp）—△外显子28（147 bp）—外显子29（190 bp）。这些结果证实了FLNA c.4599-2A > G变异破坏了正常的mRNA剪接。
Minigene分析
我们进行了minigene剪接测定，以确定c.4599-2A > G是否影响FLNA中外显子27-29基因组的剪接。我们通过将外显子27-29亚克隆到pcDNA3.1载体中获得两种不同的minigene：pcDNA3.1-FLNA-WT和pcDNA3.1-FLNA-mut。将两种minigene转染到HeLa和293T细胞中，并使用逆转录PCR分析所得转录本。随后，pcDNA3.1-FLNA-WT的PCR产物琼脂糖凝胶电泳显示单一条件（亚型a），而pcDNA3.1-FLNA-mut的PCR产物显示两条条件（亚型b和c）。
对野生型亚型a和突变型亚型b、c进行Sanger测序。测序结果显示，野生型亚型a遵循预期的剪接模式：外显子27（124 bp）—外显子28（157 bp）—外显子29（190 bp）。突变亚型b在外显子28的左侧有10-bp的缺失，导致以下异常剪接模式：外显子27（124 bp）—△外显子28（147 bp）—外显子29（190 bp）。突变亚型c显示外显子完全跳过，外显子28完全缺失，导致剪接模式为：外显子27（124 bp）—外显子29（190 bp）。
Minigene测定结果证实，FLNA c.4599-2A > G变异破坏正常的mRNA剪接，导致两种不同的异常剪接事件：（1）外显子28左侧10-bp缺失；（2）外显子28完全跳过。
讨论
本研究报告了一个携带FLNA c.4599-2A > G剪接变异的中国PNH家系。该变异位于内含子27的-2位置，影响了经典剪接位点。对先证者及其父母外周血RNA进行逆转录PCR，以研究其对基因表达的影响。仅在嵌合体父亲的样本中观察到低水平的异常转录本，而在先证者或未受影响的母亲中未检测到。考虑到FLNA是X连锁基因，且先前研究报告家族内存在随机X染色体失活（XCI），我们假设XCI和无义介导的mRNA衰变（NMD）导致了先证者血液中未检测到变异转录本。XCI具有组织特异性，变异等位基因可能在外周血中失活，而在大脑中优先表达。
我们进行了minigene测定以进一步确认RNA-seq未检测到的剪接变化，结果显示两种异常转录本：一种在外显子28的5'端有10 bp缺失，另一种完全跳过外显子28。两种转录本都含有可能触发NMD的提前终止密码子（PTC）。这一机制可以解释在嵌合体父亲外周血中观察到的低水平异常转录本。
电泳分析清楚地显示，外显子28的5'端有10 bp缺失的转录本比外显子28完全跳过的转录本更丰富。类似地，仅在父亲的外周血中检测到低水平的10 bp缺失转录本，这意味着该转录本可能是主要的剪接产物。这表明剪接机制优先使用附近的隐性剪接位点，而不是跳过整个外显子。这种偏好可以解释10 bp缺失转录本相对于外显子跳过转录本丰度更高，以及为什么仅在父亲外周血中检测到缺失转录本。此外，2004年的一项研究报告了一名患有PNH和耳-腭-指综合征的女性患者，其由单个FLNA变异引起，并鉴定出两种不同的异常转录本。这一结果进一步支持了FLNA剪接变异可导致多种转录亚型，从而导致表型变异性的观点。
我们通过血液mRNA分析和minigene测定鉴定出由FLNA c.4599-2A > G产生的两种异常转录本：c.4599_4608del（p.Ser1533Argfs13）和c.4599_4755del（p.Ser1533Argfs28）。两种转录本都引入了移码，分别在外显子28和29内产生PTC，可能导致产生截短至第1544和1559位氨基酸的蛋白质。
Filamin A包含24个免疫球蛋白样重复结构域。变异区域影响重复序列13，这是一个特别识别细胞骨架调节因子migfilin的结构域。Migfilin与多种丝蛋白（如filamin A， B， C）和肌动蛋白相互作用，对维持细胞骨架完整性至关重要。外显子28截短导致关键的filamin A结构域缺失，包括特别结合血小板受体糖蛋白的重复序列17，以及含有保守整合素结合位点的重复序列17、19、21和23。整合素是介导细胞与细胞外基质相互作用的跨膜蛋白，在细胞粘附和信号转导中起关键作用。由于filamin A是整合素的关键细胞内结合伙伴，这些保守整合素结合结构域的缺失可能会损害整合素的相互作用，进而影响细胞粘附和信号转导过程。
在这个家庭中，父亲没有表现出PNH相关症状，尽管大片段转录本缺失通常与显著的蛋白质功能障碍和更严重的疾病表型相关。这可能归因于嵌合变异状态。在FLNA相关疾病中，具有嵌合现象的男性患者通常表现出较轻微的表型。因此，我们假设FLNA变异男性患者的临床表现可能受嵌合程度的影响。具有致病性FLNA变异的男性患者的报告相对罕见，癫痫是已报道的嵌合病例中的常见特征。Elena等人报告了一名49岁男性患者，他在15岁时患上癫痫，其FLNA c.1692-2A > G变异在血液DNA中的频率为42%，在毛发DNA中为69%。同样，Guerrini描述了另一名同龄男性患者，出生时表现为高弓足和会厌分叉，随后在15岁时出现癫痫发作。FLNA c.1692-2 A > G变异在白细胞中的检出频率为42%，在毛囊DNA中为69%。这些病例为嵌合水平与临床严重程度之间的潜在相关性提供了证据，支持了我们的假设，即嵌合变异比率可能影响FLNA致病性变异男性患者的表型表现。
在这个家庭中，缺乏PNH相关表型的父亲有一个患有显著生长迟缓的杂合女儿。女儿出生时体重仅2公斤，明显低于同龄人。女儿的MRI显示灰质异位和胼胝体发育不全，从而诊断为PNH。虽然女儿尚未发生癫痫，但这可能是年龄依赖性的，我们计划进行进一步随访。
生长迟缓不是PNH的典型特征，但代表了本案例中的独特表现，在以往的PNH报告中相对罕见。先前的研究表明致病性FLNA变异与生长迟缓之间存在潜在联系。2005年的一项研究首次报告了这种关联，这可能与致病性FLNA变异导致的骨骼表型有关。Filamin A通过与filamin B形成二聚体在骨骼发育中起作用，可能导致骨骼异常。该机制涉及Rho GTP酶活性调节，从而影响肌动蛋白细胞骨架组装，进而影响成骨细胞（OB）和破骨细胞（OC）功能。OB负责骨形成和矿化，而OC介导骨吸收和重塑。FLNA在这两种细胞类型中积累，并与低密度脂蛋白受体相关蛋白6相互作用以抑制β-连环蛋白表达。这增强了依赖于活化T细胞核因子1的破骨细胞生成基因的表达，从而抑制骨形成并促进OC活性。此外，2006年一项使用Flna敲除小鼠模型的研究支持了致病性FLNA变异与骨骼异常之间的联系，显示出胸骨畸形和腭裂等缺陷。
这些结果表明，致病性FLNA变异可能不仅导致PNH的经典神经病理特征，还可能影响骨骼发育，导致生长迟缓及相关病理表型。
此外，致病性FLNA变异通常被证明会导致神经性或骨骼性表型，但不会同时导致两者。这种现象可能是由于各种致病性FLNA变异产生不同的突变蛋白，以不同的方式影响filamin A功能。这些改变的蛋白质可能通过各种分子机制影响参与神经元迁移和OB发育的关键通路。
然而，一些病例报告表明，这种互斥性可能并非绝对。例如，2011年的一项研究描述了两名被诊断为脑积水和PNH的男童，他们同时表现出骨骼异常，包括扁平脸、铲状指尖、短而宽指骨和掌骨、桡骨弯曲和腕关节脱位。此外，2004年的一项研究报告了一名患有PNH和骨盆骨发育不良的女性患者，表现出影响神经和骨骼发育的双重表型。这些案例强调了FLNA变异可能导致重叠和复杂的表型表现，表明在调查FLNA相关疾病时，需要对基因型-表型相关性有更细致的理解。
总之，本研究报道了一个受FLNA剪接变异影响的家庭，包括一名无PNH相关表型的嵌合父亲和他患有PNH和生长迟缓的女儿。这些结果为理解致病性FLNA变异在男性患者，特别是远端截短和嵌合变异情况下的影响提供了新的见解。我们推测致病性FLNA变异诱导的选择性剪接事件可能是导致观察到的表型变异性的关键因素。这些结果增强了我们对FLNA基因功能的理解，并扩展了FLNA相关疾病的遗传和表型谱。然而，我们的发现基于单个家庭，需要进行涉及更大队列和先进分子技术的进一步研究来验证这些观察结果。
