《Plant Biotechnology Journal》：Mechanical Strength: An Unrecognised Target in the Genetic Improvement of Crops
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本研究创新性地揭示了玉米叶角（LA）并非静态性状，而是由维持叶片直立的机械支持力与促使叶片下垂的下垂力之间的动态平衡所决定。通过引入重力矩（Mgrav）概念及单细胞转录组（snRNA-seq）等技术，文章系统阐明了叶舌区（ligular region）厚壁组织（SC）细胞层数、木质素沉积（尤其向轴面adaxial侧）及NAC转录因子（如NST2/NST3）在增强机械支持、减小叶角中的核心作用，为通过调控机械强度实现作物株型优化和高产育种提供了新策略。
引言：叶角——决定作物株型与产量的关键性状
植物株型是影响作物形态和产量的最关键因素之一，由株高、分蘖数与角度、分枝模式、叶形态和穗结构等多种性状复杂互作塑造。其中，叶形态，特别是其维度属性——叶片长度（BL）、叶片宽度（BW）、叶片重量（BWt）和叶角（LA）——在优化植物株型中起着关键作用。LA被定义为叶片中脉与茎轴之间的倾斜角，是显著影响紧凑度、种植密度、冠层结构、光合效率、生物量和产量的主要决定因素。过去几十年，全球玉米产量的增长在很大程度上归功于具有减小叶角和直立叶片的杂交品种密度的增加。因此，解析LA形成的调控机制已成为植物生物学和作物科学的重要焦点。
先前研究表明，LA的形成主要由叶舌区（又称叶枕关节）的发育和细胞变异决定，这是一个连接叶片和叶鞘的铰链结构，由叶舌、叶耳和连接的中部区域组成。该领域的重要里程碑包括20世纪90年代在玉米中鉴定出LA的主要发育调节因子Liguleless1 (LG1)和LG2。随后的研究在其他作物（如水稻和小麦）中表征了这些基因的同源物，揭示了它们在调节LA和穗分枝角度中的保守作用。尽管取得了这些显著进展，但关于LA调控的基本问题仍未解决，特别是：（1）LA调控在不同物种间的进化保守性与分化；（2）参与LA形成的发育和细胞过程；（3）内部发育因子（如激素）与外部环境信号（如光、温度、风、重力）在调节LA中的协调。本研究强调了机械强度在调节作物株型中的重要作用，并深入分析了维持叶形态的机械支持系统在不同物种间的保守性与变异。
结果1: 禾本科植物叶舌区的比较组织学分析
考虑到禾本科植物的叶片具有相似的架构，包括叶鞘、叶片和连接的铰链区域，这表明禾本科内的物种可能共享调控LA形成的进化保守机制。为了识别影响LA的关键因素，我们对两个生长阶段（幼年和成年）的6种系统发育多样的禾本科植物（玉米、水稻、小麦、谷子、青狗尾草和马唐）的叶片性状进行了全面分析。研究发现，栽培作物（小麦、谷子、水稻和玉米）的LA通常低于40°，显著小于杂草（青狗尾草和马唐）的50°–60°。有趣的是，主要作物的叶片长度通常超过20厘米，玉米叶片可达60-80厘米，而杂草和小麦的叶片通常较短（约10-20厘米）。值得注意的是，玉米叶片显著更宽（8-10厘米，是其他物种的7-9倍）、更重（10-20克，是其他物种的70-80倍），却仍能维持较小的LA。这种极端叶片尺寸和重量与窄LA的组合表明，玉米可能具有支持其叶结构的独特生物力学特性。
进一步的切片和木质素染色分析揭示，具有短叶片的物种（包括杂草、小麦和谷子）其叶舌区厚度一般小于1.5毫米，而具有较长叶片的物种（如水稻和玉米）其叶舌区厚度超过2毫米。此外，维管束（Vb）的密度和分布模式，以及厚壁组织（SC）细胞的厚度和层数，在不同物种间存在显著差异。例如，在小麦、谷子和玉米等作物中，Vb主要局限于远轴面，丰富的薄壁细胞占据中心区域。相反，水稻显示出更复杂的排列，Vb有序地分布在向轴面和远轴面，木质素沉积特异性地定位于远轴面SC细胞。值得注意的是，在水稻的叶枕关节中独特地观察到多个大的通气腔，这凸显了其适应水生环境的显著进化适应。
更引人注目的是，玉米植株表现出叶舌区厚度、Vb数量、SC细胞层数和厚度以及木质素沉积的显著增加。这些刚性结构可能提供了足够的机械强度和加固，以支撑其异常大而重的叶片保持直立。总之，我们的细胞学结果表明，叶舌区 distinct 的模式和组成与植物的进化适应和驯化密切相关，并在调控LA形成中起着关键作用。
结果2: 影响LA的力与力矩的力学分析
考虑到叶片是从叶鞘延伸出的伸展、薄、柔韧的弹性结构，叶舌区 function 如同一个铰链式的柔性结构和力学相互作用点，通过抵消重力诱导的下垂力来维持叶片处于直立的倾斜位置并使其更靠近茎秆。为了量化导致叶片向下弯曲的力，我们引入了重力矩（M）的概念，这是改变物体旋转状态的物理量，定义为 M = d × F。其中，d是力臂，代表从力的作用线到旋转轴的垂直距离；在植物叶片中，这对应于从叶片重心（或实际质心）到叶舌区的水平距离分量。F是力，代表叶片重量的垂直分量。
在将叶片简化为具有均匀质量分布的简单刚体的假设下，重力矩可简单定义为 Mgrav= (1/2 BL) × BWt × g × sin(LA)。将此公式应用于各种禾本科植物计算重力矩后发现，具有较长叶片的物种（如谷子、水稻和玉米）表现出显著大于短叶片物种的重力矩。值得注意的是，玉米植株的重力矩大约是短叶片物种的100-300倍，这主要归因于其细长、更宽、更重的叶片通过延长的叶片杠杆臂增强了扭矩。为了验证重力矩是代表作用于叶片的下垂力的合理且重要因素，我们计算了147个玉米自交系的重力矩，并进行了重力矩与各种叶片性状的相关性分析。结果显示，重力矩与LA（R2, 0.7694）、BWt（R2, 0.7557）和BL（R2, 0.5815）呈正相关。这些发现表明，重力矩是代表作用于叶片的下垂力并阐明LA调控的合理且可靠的参数。
结果3: 机械力维持叶片的直立性
为了维持叶片精确的倾斜角并有效抵御风和雨等环境压力，由茎秆和叶鞘产生的集体支撑力和抵抗力，以及叶片本身的拉伸和抗压强度，必须大大超过下垂力的影响。为了分析这些支撑力和抵抗力，我们将其分解为水平（Fx）和垂直（Fy）两个分量，进行了更详细和系统的研究。
对玉米和水稻叶片领环区域和茎秆连接处的横截面分析表明，在垂直方向，来自叶片的重力通过直接的叶鞘-茎秆连接传递到地面。同时，茎秆和叶鞘产生一个向上的反作用力支撑叶舌区和叶片，有助于保持直立。在不同禾本科物种中，这种垂直支撑强度与叶鞘和叶舌区的Vb密度、SC厚度和层数以及木质素含量呈正相关。Vb数量或木质素含量减少的物种表现出较大的LA，尤其是在杂草中。此外，由中脉提供的机械支撑强度，特别是其拉伸和抗压强度，进一步增强了叶片的直立性。这在玉米无中脉叶片突变体drooping leaf1 (drl1)中尤为明显，其机械支撑的减少导致LA增加和叶片下垂，强调了叶片组成，特别是叶鞘和叶片中Vb数量和木质素含量在抵抗下垂力中的关键作用。
对于水平抵抗力（Fx），我们重点关注叶领环内的表面摩擦和结构阻力。玉米叶鞘在茎秆周围形成紧密包裹的层，增强了茎秆和叶鞘层之间的摩擦，从而减小了LA。相比之下，水稻叶鞘包裹茎秆的效果较差，重叠较少，减少了表面摩擦和内部阻力。这很可能解释了水稻，特别是其下部叶片观察到的较大LA。此外，玉米的LA从顶部到底部逐渐增加。对不同叶位叶鞘包裹程度的分析表明，叶鞘包裹程度与叶角呈负相关。为了进一步验证叶鞘对LA形成的贡献，我们分析了玉米narrow sheath and drooping leaf 1 (nd1)突变体。与野生型（WT）植物相比，nd1突变体幼苗和成熟植株的叶鞘宽度显著减小，围绕茎秆的包裹被破坏，导致LA显著增加、叶片下垂，株型类似于水稻。这些发现证实了茎秆到叶鞘的阻力和摩擦力对于防止叶片下垂至关重要。
结果4: 打破支撑力与下垂力之间的平衡会改变LA
为了验证机械强度、植物株型与玉米叶舌区木质素沉积之间的关系，我们首先根据不同叶位的LA测量结果对自交系进行了分类。具体而言，利用穗上第二叶（上部叶）和穗下叶（下部叶）的LA，将玉米自交系划分为三种不同的株型：紧凑型（上下部LA均小于20°）、扩展型（上下部LA均大于30°）和中间型（下部LA小于20°且上下部LA相差10°以上）。基于这些标准，共选择了30个代表三种株型的自交系进行后续分析。
结果显示，对于不同叶位，所有自交系中具有小LA的上部叶的重力矩显著低于具有较大LA的下部叶。这表明下部叶需要更大的支撑力来维持其现有的LA。此外，我们观察到对于不同自交系，紧凑型自交系（如Z58）的重力矩小于扩展型自交系（如W22）。这表明与紧凑型自交系相比，扩展型自交系需要更大的支撑来维持其现有的LA。
为了验证下垂力对LA的影响，对各种玉米自交系进行了长期外部负载处理。统计结果显示，在V3阶段（叶舌刚刚突破叶鞘）的玉米幼苗第3叶（L3）上悬挂1克外部负载一周后，B73、W22、Mo17和KN5585的LA分别比对照增加了70%、31%、66%和64%。结果表明，长期负载显著增加了玉米叶片的LA，且这种效应是稳定且不可逆的。为了进一步分析不同玉米自交系和叶位之间的支撑能力，我们施加了递增的外部向下力（通过增加负载）来测量叶片发生形变的最大阈值。结果显示，每个自交系内上部叶比下部叶承受更高的负载，证实了其更强的支撑能力。此外，紧凑型自交系的叶片支撑能力显著大于扩展型自交系。在测试的自交系中，扩展型自交系的下部叶表现出最低的承载能力（平均3.50 N），而紧凑型自交系的上部叶表现出最高的承载能力（平均4.94 N）。这表明紧凑型玉米提供的支撑能力显著超过了平衡下垂力的需求，从而形成了更稳定的植物株型。
重要的是，木质素染色显示，在小LA叶片的叶舌向轴面区域有显著的木质素沉积，而在大LA叶片中则缺乏这种向轴面木质素沉积。这一发现验证了向轴面木质素在防止叶片下垂中的重要作用。值得注意的是，木质素丰度和向轴面SC层数与支撑能力呈正相关。例如，Sup1表现出约5层向轴面SC，Z58和B73表现出约15层，而W22则完全缺乏向轴面SC。这很可能解释了紧凑型自交系对外部负载处理具有更大耐受性的原因。
结果5: 构建三个自交系叶舌区细胞的综合图谱
为了在单细胞分辨率下研究不同玉米自交系叶舌区 distinct 的细胞类型，我们进行了snRNA-seq分析。收集了W22、B73和Z58植株的叶舌区（第二叶，V3阶段）用于snRNA-seq。我们使用>200个基因/细胞核的严格标准获得高质量数据用于后续分析。结果，共有18,427个细胞核通过质量控制，用于构建综合的整合细胞图谱。我们使用均匀流形近似和投影（UMAP）进行降维和可视化，最终在叶舌区识别出34个推定细胞簇（C0-C33）。
为了注释这些细胞簇，使用了多个先前建立的叶舌区标记基因。与叶舌区的实际细胞结构一致，注释了多种细胞类型，包括韧皮部、木质部、向轴面维管束鞘（BS-ad）、远轴面维管束鞘（BS-ab）、叶肉细胞、表皮细胞和下皮层细胞。在这些下皮层细胞中，细胞扩张相关基因，包括alpha expansin 1 (EXPA1)、EXPA5和EXPB8，在簇C2、C6、C8、C9、C12和C18中高表达，表明这些细胞可能代表下皮层（HP1和HP5）细胞。多种激素相关基因，如BRD1，在C7、C16和C20中富集，表明这些（HP2）细胞可能占据下皮层附近以调节激素反应。总之，我们构建了一个全面的叶舌区细胞图谱，揭示了13种主要细胞类型，这将有助于探索叶舌区的功能细胞类型和调节因子。
结果6: 三个自交系叶舌区细胞图谱的比较分析识别出木质化的向轴面下皮层细胞
为了详细分析三个自交系叶舌区细胞类型的差异，我们对这些自交系的snRNA-seq结果进行了全面分析。三个自交系映射结果的比较分析显示，大多数细胞簇是保守的，差异主要在细胞数量上。通过对不同细胞簇细胞数量的比较分析，我们发现HP3细胞簇（C11, C26）仅存在于Z58和B73的组织中，而HP4细胞簇（C23）是W22组织独有的。我们认为HP3和HP4细胞之间的差异与三个自交系叶舌向轴面下皮层细胞的木质素沉积密切相关。
为了研究C11、C23和C26中富集基因的功能，我们对特异性基因进行了基因本体（GO）分析。结果表明，C11、C23和C26中富集基因的功能主要集中在磷酸盐代谢、细胞蛋白质代谢和苯丙烷代谢。此外，我们的分析显示，一些木质素生物合成相关基因在HP3中特异性富集，如过氧化物酶26 (PRX26)、4-香豆酸辅酶A连接酶2 (4CL2)和羟基肉桂酰辅酶A莽草酸/奎宁酸羟基肉桂酰转移酶7 (HCT7)，这可以归因于叶舌木质素合成发生在多种细胞类型中，如远轴面SC细胞和木质部细胞。此外，我们观察到与木质素生物合成相关的转录因子表达水平相对较低，可能是由于收集的组织较年轻，因为向轴面区域的木质素合成主要发生在幼苗阶段。
结果7: NST2和NST3通过调节向轴面木质素沉积来影响机械强度和LA
为了进一步分析在Z58、B73和W22等自交系中调节叶舌向轴面和远轴面木质素合成的基因，我们重新评估了先前发表的这些自交系成熟植株的转录组数据，并特别关注了W22向轴面和远轴面的差异表达基因（DEGs）。我们的分析在W22的向轴面特异性地识别出1244个下调基因和1228个上调基因。GO分析表明，向轴面下调基因的功能主要富集于木质素代谢、葡聚糖代谢、应激反应、信号转导和生物过程调节。我们关注了参与这些生物过程的转录因子，包括NAC转录因子（如NST1、NST2、NST3和NST4）、骨髓细胞增生症（MYB）转录因子（如MYB18和MYB27）和碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子（如bHLH9和bHLH135）。NAC和MYB转录因子是众所周知的木质素生物合成调节因子。
RT-qPCR分析显示，NAC转录因子NST1、NST2、NST3、NAC16、NAC65和NAC47，以及MYB转录因子MYB70、MYB77和MYB79，在W22自交系叶舌区表现出向轴面和远轴面特异性的差异表达，在远轴面的表达水平显著高于向轴面。相比之下，在B73和Z58自交系中，这些区域之间未观察到显著的差异表达。这些发现与先前三个自交系的转录组分析和细胞学观察一致，表明NST1、NST2、NST3、NAC16、NAC65、MYB70、MYB77及相关因子可能参与调节叶舌区的木质素积累，从而影响机械强度和叶角。此外，我们选择NST2和NST3进行RNA原位杂交，以验证它们在W22和Z58叶舌中的表达模式。结果显示，NST2和NST3转录本主要积聚在远轴面维管束鞘、厚壁组织细胞，以及向轴面叶舌、表皮和下皮层细胞——这些区域与木质素沉积相关。这种空间表达模式有力地支持了我们的假设，即NST转录因子调节叶舌区的木质素沉积，最终影响机械性能和叶角调节。
为了验证NSTs在LA调节和机械强度中的作用，我们获得了NST2和NST3的功能丧失突变体。表型观察显示，与野生型相比，nst2和nst3突变体的LA显著增加，表明NST2和NST3负调控LA。力学测试结果表明，虽然NSTs突变体的重力矩与野生型相比没有显著差异，但nst2和nst3突变体耐受的最大向下力显著降低，表明NST2和NST3正调控玉米的机械支撑能力。与这些发现一致，组织切片分析显示，nst2和nst3突变体叶舌的木质素沉积显著减少，向轴面完全缺乏木质素沉积。这表明NST2和NST3通过调节木质素生物合成，特别是在叶舌区的向轴面，来负调控叶角并正调控机械支撑能力。这些结果进一步证实了叶舌，特别是向轴面区域木质素沉积的水平与机械支撑能力正相关，与叶角负相关，这与我们先前的结论一致。
讨论：机械支持——作物改良的新靶点
植物株型是由分枝、叶片和生殖结构的三维组织定义的复杂表型，由进化适应和农业选择塑造。解析其潜在的调控机制对于作物的遗传改良至关重要，能够实现有针对性的株型修饰以增强植物性能和谷物产量。本研究调查了发育和细胞机制，以及控制禾本科植物这种形态多样性的遗传网络，重点关注动态机械强度如何调节叶角，揭示了保守原理和谱系特异性创新。
机械支持对于植物生长和发育至关重要，依赖于细胞壁、木质部、根和茎等结构的协调作用。这一系统使植物能够在多变的环境条件下保持稳定、直立的形态。主要由纤维素、半纤维素和果胶组成的初生细胞壁为结构提供了基本的刚性和强度。以木质素沉积增加为特征的次生细胞壁显著增强了机械强度，尤其是在SC和木质部细胞中。我们的研究结果表明，叶舌区向轴面SC细胞层内的木质化，加上Vb（木质部）分布和密度的增加，对于叶片，尤其是玉米叶片的机械加固至关重要。尽管叶片的向外延伸提高了光捕获效率，但它同时增加了对环境刺激（如风）的结构不稳定性。在进化和自然选择过程中，各种禾本科植物进化出不同的策略来解决这种权衡。叶片较短的物种（如狗尾草、黑麦草、小麦）通过最小化叶片重量来减轻环境刺激的不利影响。相反，玉米驯化选择了扩大的叶片面积以最大化光合能力和谷物产量，推动了强大机械支持系统的进化以确保结构稳定性。
先前关于LA的研究主要集中在叶舌区形态学（如叶耳区域、叶舌和叶耳的出现、不对称分裂/伸长）。我们的研究结果确定，LA与支撑能力负相关，与叶片重量产生的向下弯曲力正相关。我们证明，支撑能力与向下弯曲力之间的平衡对于维持叶片姿态至关重要。在狗尾草和小麦等物种中，较弱的支撑系统 combined 相对较重的叶片导致较大的LA甚至叶片下垂。相比之下，拥有强大支撑系统的玉米和水稻证明，叶舌区提供的支撑显著超过了叶片的机械需求，促进了向上生长。支撑能力主要取决于机械强度，包括叶鞘、叶片中脉和小叶脉的韧性、SC细胞层数以及叶舌区的细胞壁厚度。此外，叶鞘围绕茎秆的包裹程度和层数显著影响支撑能力和LA。
通过对不同玉米自交系不同叶位的创新性机械支撑能力评估和组织切片分析，我们发现了叶舌向轴面木质化与叶角以及机械强度之间的密切关系。具有高度向轴面木质化的叶片通常表现出更强的机械支撑和更小的LA。这一发现阐明了在“上紧下松”型玉米中观察到的有趣现象，即上部叶片向轴面末端有明显的木质素沉积，而下部叶片在同一位置则没有木质素沉积。
对三个代表性玉米自交系（Z58、B73和W22）叶舌的snRNA-seq分析揭示了向轴面末端下皮层细胞的显著差异。具体而言，HP3存在于B73和Z58自交系中，而HP4存在于W22自交系中。对HP3和HP4中特异性富集基因的详细分析表明，木质素生物合成相关基因（如PRX26、4CL2和HCT7）在HP3中显著富集，但在HP4中几乎检测不到。这表明HP3和HP4代表了向轴面木质素沉积的不同区域。总之，叶舌向轴面下皮层细胞是否发生木质化是决定
