水稻免疫受体XA21通过识别内源信号肽OsRALF26增强抗病性的分子机制

《Plant Biotechnology Journal》：OsRALF26 Serves as an Endogenous Signal Recognised by XA21 to Promote Robust and Distal Resistance in Rice

本研究发现，水稻重要抗病受体XA21不仅能识别病原菌来源的硫酰化肽RaxX，还可直接结合宿主自身分泌的快速碱化因子OsRALF26。这种对内源信号和外源信号（微生物来源）的双重识别机制，构成了一个正反馈环路，不仅显著增强了XA21介导的免疫强度，还促进了免疫信号向远端组织的空间传播，从而赋予水稻对白叶枯病菌（Xanthomonas oryzaepv. oryzae， Xoo）更强大、更持久的抗性。该研究揭示了一种通过整合内外源信号实现免疫稳健性的新策略。

　　

文章内容归纳

1 引言

植物免疫受体通常分为定位于细胞膜的模式识别受体（PRRs）和位于细胞质的核苷酸结合位点富含亮氨酸重复蛋白（NBS-LRRs）。PRRs通过识别保守的微生物来源或植物内源信号（传统上分别称为病原相关分子模式PAMPs和损伤相关分子模式DAMPs）来启动模式触发免疫。XA21是一个备受关注的水稻LRR受体样激酶（RLK），最初从长雄蕊野生稻中克隆获得，因其结构和膜定位常被归类为PRR。然而，它介导的对白叶枯病菌（Xanthomonas oryzaepv. oryzae， Xoo）的强效、小种特异性抗性，则更常见于NBS-LRR受体。XA21能识别某些Xoo菌株分泌的微生物酪氨酸硫酰化肽RaxX-sY。尽管这种识别机制解释了XA21的抗性特异性，但其异常强大的免疫激活分子基础仍不清楚。

快速碱化因子（RALF）是一类小分泌肽，以其通过结合长春花RLK1样（CrRLK1L）蛋白激酶家族抑制H⁺-ATPase活性、快速碱化质外体、抑制细胞延伸的功能而闻名。最近的研究揭示，某些RALF肽在病原体攻击时被释放，可作为内源信号触发免疫反应，符合典型DAMP的分类。OsRALF26是之前被鉴定为FERONIA样受体1（OsFLR1）的一个水稻特异性配体，可被XA21信号转录诱导并通过其经典受体OsFLR1增强抗病性。本研究旨在探究OsRALF26是否也是XA21的直接配体，以及这种相互作用如何促进XA21介导的免疫反应的强度和空间动态。

2 结果

2.1 OsRALF26在体外和植物体内直接与XA21相互作用

研究发现，外源施用成熟重组形式的OsRALF26能进一步增强过表达XA21的水稻植株的抗性，并更强地抑制其根伸长，提示XA21可能参与OsRALF26的感知。酵母双杂交、体外Pull-down、双分子荧光互补以及体内免疫共沉淀实验均证实，OsRALF26与XA21的胞外域（XA21^ECD）存在特异性直接相互作用，而与其同源蛋白OsRALF27则无此作用。这些结果从机制上为OsRALF26参与XA21介导的免疫信号转导提供了基础。

ECD的体外结合。C. 双分子荧光互补实验可视化OsRALF26与XA21在植物体内的相互作用。D. 免疫共沉淀实验验证OsRALF26与XA21在烟草叶片中的相互作用。">

2.2 XA21是水稻中OsRALF26的新型免疫受体

为了区分OsRALF26和XA21的经典配体RaxX触发的免疫反应，研究使用了无法硫酰化RaxX的Xoo突变菌株ΔraxST。处理OsRALF26^mat可增强表达XA21的植株对Xoo^ΔraxST的抗性，表现为病斑长度和细菌数量显著减少，且效果强于不表达XA21的对照。同时，OsRALF26^mat在XA21存在时能更强地诱导防御标记基因PR2和PR10的表达，并触发更剧烈的活性氧（ROS）爆发。这些结果表明，OsRALF26在XA21存在时能更强地激活典型免疫反应，暗示XA21是OsRALF26的潜在免疫受体。

mat预处理增强了表达XA21的植株对Xoo^ΔraxST的抗性。B. 病斑长度和细菌数量的定量分析。C. OsRALF26^mat处理后PR2和PR10基因的表达水平。D. OsRALF26^mat处理后在表达XA21的植株中触发更强的ROS爆发。">

2.3 XA21自身足以介导OsRALF26触发的免疫

为了确定XA21自身是否能介导OsRALF26触发的免疫，研究利用不响应OsRALF26的本氏烟作为异源系统。在本氏烟叶片中瞬时表达XA21后，OsRALF26^mat处理可触发强烈而快速的ROS爆发，并增强对病原细菌Pseudomonas syringaepv. tomatoDC3000的抗性，而对照处理无此效果。进一步使用激酶失活突变体XA21^K736E的实验表明，OsRALF26诱导的ROS产生依赖于XA21的激酶活性。这些结果证实，当XA21存在时，OsRALF26可作为内源信号发挥功能，且该受体自身足以介导OsRALF26触发的免疫。

mat处理后产生显著的ROS爆发。C. OsRALF26^mat预处理增强了表达XA21的叶片对病原菌PstDC3000的抗性。">

2.4 通过XA21和OsFLR1双重识别OsRALF26增强免疫信号

在水稻中，OsRALF26不仅被其经典受体OsFLR1识别，也被XA21识别。为验证双重识别是否能放大免疫反应，研究在本氏烟中共同表达了XA21和OsFLR1。结果表明，当两种受体共表达时，OsRALF26^mat诱导的ROS爆发比单独表达任一受体时都更强、更持久，且对病原菌的抗性也更强。这意味着在水稻中，这两种受体的内源性共同表达可能通过独立或协同作用，有助于实现OsRALF26介导的免疫信号的强度和稳健性。

mat处理后产生更强的ROS爆发。C. 共表达两种受体的叶片表现出更强的病原菌抗性。">

2.5 OsRALF26是远端组织中XA21介导免疫信号所必需的

为了研究OsRALF26在XA21介导免疫中的作用，研究构建了在其自身启动子下表达XA21的转基因水稻，并在此背景下通过RNAi沉默OsRALF26。尽管细菌在感染早期局限于局部组织，但表达XA21的植株在远端叶片区域显示出升高的PR基因表达，而这种模式在OsRALF26沉默株系中显著减弱。这表OsRALF26是远端组织完全激活XA21依赖性免疫所必需的。

进一步的两步接种实验（先用野生型Xoo激活XA21，再用无法激活XA21的Xoo^ΔraxST接种远端组织）表明，在野生型植株中，预先激活XA21能显著增强远端组织对后续病原菌入侵的抗性。而在OsRALF26沉默株系中，这种远端的免疫激活能力受损。综合来看，这些结果支持了一个模型：即被XA21局部诱导的OsRALF26，通过双重受体（OsFLR1和XA21）的参与，协调了远端组织的免疫预备状态。

Xoo^WT后的表型。B. 病斑长度和细菌数量的定量。C. OsRALF26沉默株系中RaxX-sY诱导的PR2和PR10表达降低。D. OsRALF26沉默株系中RaxX-sY诱导的ROS爆发减弱。">

PR10基因的诱导表达减弱。">

3 讨论

本研究证明，OsRALF26不仅能通过其经典受体OsFLR1激活免疫，还能与XA21相互作用。这种双重配体识别扩展了XA21的功能库，并为其强大且空间扩展的免疫活动提供了机制解释。与典型的PRR或NBS-LRR分类不同，XA21感知两种结构、功能和进化上截然不同的配体（RaxX和OsRALF26）的能力，将其重新定义为一种整合微生物识别与宿主来源信号放大的双功能免疫受体。这种配置形成了一个正反馈循环：对微生物来源RaxX的初始识别诱导OsRALF26的产生，而OsRALF26反过来又增强并空间扩展了XA21的信号传导。这种机制可以解释与XA21相关的异常强大的免疫反应。

RALF肽家族成员可以与结构多样的伙伴结合，显示出显著的结构可塑性。本研究中，当两种受体共表达时，OsRALF26诱导的反应被放大，表明存在加性或协同的信号传导。这种双重识别需要进一步研究其是否募集相同的受体复合物或不同的共受体模块。对配体特异性XA21复合物的组成和动力学进行解析，将有助于确定微生物来源和内源信号在下游信号传导中是汇聚还是分流。

这种双重识别不仅放大了局部免疫反应，还支持了XA21介导的防御的空间传播。作为一种小分泌肽，OsRALF26在结构上由保守的二硫键稳定，其转录被XA21诱导，并能直接与XA21相互作用，使其有充分的条件促进免疫激活超越初始感染部位。尽管未直接追踪OsRALF26肽在叶片中的移动，但其空间表型支持了一个模型，即OsRALF26（或依赖于OsRALF26的下游信号）促进了远端组织中的防御激活。

对多种水稻野生种的分析显示，OsRALF26响应性在稻属内广泛保守，而RaxX的识别则仅限于长雄蕊野生稻。这表明，在将XA21基因渗入栽培稻的过程中，可能同时获得了对OsRALF26的感知能力。这种对OsRALF26感知的协同获得，可能通过将微生物识别与宿主来源的信号放大相结合，从而增强了携带XA21的水稻品种的抗性稳健性。