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本项研究聚焦于RNA结合蛋白TDP-43和FUS在转录终止中的功能。研究人员揭示了这两个与肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）密切相关的蛋白，通过RNA聚合酶II（RNAPII）C末端结构域（CTD）R1810对称性二甲基化（R1810me2s）-SMN通路被募集，进而解析转录终止区的R-loop结构，从而促进高效转录终止。当该通路被破坏时，会导致RNAPII终止缺陷、R-loop堆积和DNA损伤。该研究不仅阐明了TDP-43和FUS在转录调控中的新机制，也为其功能失调如何导致基因组不稳定及神经退行性疾病发病提供了新的见解。
在细胞生命的核心进程中，遗传信息从DNA转录为RNA，再翻译成蛋白质，这一流程的精妙调控是维持生命的基础。其中，转录的“停止”信号——即转录终止，与起始和延伸同等重要。想象一下，如果一辆高速行驶的列车（RNA聚合酶II， RNAPII）无法在正确的站点（基因末端）及时刹车，它不仅会冲过站台，还可能引发轨道堵塞（R-loop堆积）甚至脱轨事故（DNA损伤）。在真核生物中，转录终止的缺陷与多种人类疾病，尤其是神经退行性疾病，紧密相连。
肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）是两类毁灭性的神经退行性疾病，其共同特征包括RNA结合蛋白TDP-43和FUS的异常聚集和功能丧失。这些蛋白参与广泛的RNA加工过程，但它们在转录终止这一基本步骤中的具体作用尚不清晰。与此同时，一种称为R-loop的三链核酸结构（由RNA与DNA模板链杂交形成，同时置换出非模板链）在转录终止区域自然积累。R-loop的及时解析对RNAPII的有效释放至关重要，而其异常堆积会干扰DNA复制、修复和转录，导致基因组不稳定。此前的研究已经发现，RNAPII C末端结构域（CTD）上一个精氨酸残基（R1810）的对称性二甲基化修饰（R1810me2s），能够通过其Tudor结构域募集衔接蛋白SMN，进而招募DNA/RNA解旋酶SETX来解析转录终止位点的R-loop。那么，与ALS/FTD密切相关的TDP-43和FUS，是否也参与了这条R-loop解析通路呢？这项发表在《Journal of Biological Chemistry》上的研究旨在回答这个问题。
为了探索TDP-43和FUS在转录终止中的作用，研究人员运用了一系列细胞和分子生物学技术。首先，他们利用免疫共沉淀（Co-IP）和染色质免疫沉淀（ChIP）技术，在人类胚胎肾细胞（HEK293）和伯基特淋巴瘤细胞（Raji）中验证了蛋白质间的相互作用及其在染色质上的定位。通过构建并利用CRISPR/Cas9基因编辑、shRNA稳定敲降以及α-amanitin（鹅膏蕈碱）处理等细胞模型，研究人员特异性破坏了R1810me2s-SMN通路的关键节点（如内源性POLR2A R1810A突变、SMN或PRMT5敲除/敲降）或TDP-43/FUS本身。接着，他们结合ChIP-定量PCR（qPCR）和全转录组ChIP测序（ChIP-seq）在全基因组水平评估了RNAPII的占据情况。为了检测R-loop的积累，研究采用了特异性识别RNA/DNA杂交体的S9.6抗体进行DRIP-qPCR，以及表达RNase H1 R-loop结合结构域（GFP-HB）的细胞系进行ChIP。此外，通过分析已发表的TDP-43 iCLIP-seq（个体核苷酸交联免疫沉淀测序）、ChIP-seq和DRIP-seq公共数据集，研究人员在全基因组层面关联了TDP-43的RNA/DNA结合位点与R-loop形成区域。最后，通过构建并过表达野生型及RNA识别基序（RRM）缺失的TDP-43突变体，直接验证了其RNA结合活性在功能中的必要性。
SMN、TDP-43和FUS与转录终止因子相互作用
研究人员首先证实，SMN与TDP-43、FUS存在直接或间接的相互作用，并且这些蛋白彼此之间以及与已知的转录终止因子（如RNAPII、SETX、XRN2）也形成一个相互作用网络。免疫荧光染色显示TDP-43和FUS主要定位于细胞核，与RNAPII及终止因子共定位。这些相互作用即使在用核酸酶处理裂解液以减少RNA/DNA介导的假阳性后依然存在，并且部分不依赖于RNAPII本身。
TDP-43被募集至RNAPII依赖于SMN和CTD R1810
ChIP-qPCR实验显示，TDP-43和FUS沿着模型基因ACTB的全长分布。当RNAPII CTD上的R1810被突变为丙氨酸（R1810A）时，TDP-43与RNAPII的相互作用及其在染色质上的募集效率显著降低，而FUS的降低程度相对较轻。同样，敲低或敲除SMN或精氨酸甲基转移酶PRMT5（负责催化R1810me2s修饰），也会削弱TDP-43与RNAPII的关联，但对FUS的影响较小。这表明TDP-43（其次是FUS）通过R1810me2s-SMN通路被招募到正在转录的RNAPII上。
内源性RNAPII R1810A突变体存在RNAPII终止缺陷
研究人员利用CRISPR/Cas9技术构建了内源性POLR2A基因R1810A纯合敲入的HEK293细胞系。ChIP-qPCR分析发现，与野生型相比，R1810A突变导致RNAPII在ACTB和GAPDH基因的终止区域堆积，证实了该突变引起转录终止缺陷。同时，SMN和TDP-43在突变细胞中与RNAPII的共定位也显著减少，而FUS的减少不明显。
FUS和TDP-43对RNAPII转录终止至关重要
敲低或敲除FUS或TDP-43会导致RNAPII在多个基因终止区的积累。全基因组RNAPII ChIP-seq分析进一步证实，缺失FUS或TDP-43会引起广泛的RNAPII在启动子区和终止区的堆积，凸显了这两个蛋白在全局转录终止调控中的关键作用。
TDP-43通过结合RNA来调控RNAPII转录终止以解析R-loop
研究发现，内源性RNAPII R1810A突变会导致终止区R-loop堆积。通过整合公共数据集，研究人员发现TDP-43的RNA结合位点（由iCLIP-seq鉴定）与R-loop富集区域高度重合，且其结合基序为富含UG的序列，与其DNA结合基序（富含C）不同。功能实验表明，过表达野生型TDP-43可以降低R-loop水平，而过表达缺失RNA识别基序（RRM）的TDP-43突变体则无法发挥此功能，并且会导致RNAPII在终止区堆积。这证明TDP-43的RNA结合活性对其解析R-loop、促进有效终止是必需的，其机制可能是通过结合新生RNA链，防止其与DNA模板链退火形成R-loop。
FUS和TDP-43可防止终止位点R-loop和DNA损伤的积累
敲低FUS或TDP-43会导致ACTB基因终止区R-loop的显著积累，这一现象通过S9.6抗体和GFP-HB融合蛋白两种方法均得到证实。此外，R1810A突变或敲低FUS/TDP-43还会导致终止区DNA损伤标志物γH2AX信号的增加。这表明FUS和TDP-43与R1810me2s、SMN、SETX协同作用，通过解析R-loop来维持转录终止的正常进行，并防止由此产生的DNA损伤。
结论与讨论
本研究建立了TDP-43和FUS与R-loop解析及转录终止之间的机制联系。研究结果表明，TDP-43和FUS作为精氨酸二甲基化修饰的蛋白，通过RNAPII CTD R1810me2s-SMN通路被募集到转录复合体上。其中，TDP-43强烈依赖此通路，而FUS则可能还存在不依赖于此通路的其他结合方式。一旦被募集，TDP-43（可能还有FUS）利用其RNA结合能力，通过隔离新生RNA来防止R-loop的形成或稳定，从而促进高效的转录终止。当这一通路因TDP-43/FUS功能丧失（如在ALS/FTD中它们被错误地隔离在细胞质包涵体中）或上游信号（如R1810me2s修饰或SMN缺陷）受损而被破坏时，会导致R-loop在基因末端异常堆积，引发转录终止缺陷、DNA损伤和基因组不稳定。
这一发现具有多重重要意义。首先，它在分子水平上将两个主要的神经退行性疾病相关蛋白（TDP-43和FUS）与一个基础的转录调控过程（终止）和基因组完整性维护机制（R-loop解析）直接联系起来，为理解ALS和FTD的发病机制提供了全新视角。其次，研究揭示了SMN作为一个多功能支架蛋白，不仅与脊髓性肌萎缩症（SMA）相关，还可能通过组织包含TDP-43/FUS在内的精氨酸二甲基化蛋白复合物，在转录终止中扮演核心角色，这暗示了SMA与ALS/FTD之间可能存在重叠的分子病因。最后，该研究强调了运动神经元可能因其表达大量长基因而特别容易受到转录终止缺陷和R-loop介导的DNA损伤的影响，这或许能部分解释在TDP-43/FUS功能失调的神经退行性疾病中，运动神经元的选择性脆弱性。总之，这项研究深化了我们对转录终止调控机制的理解，并揭示了其在维持神经元健康和防止神经退行性疾病中的关键作用。
