编辑推荐：
选择性定量分析d-氨基酸对功能研究和生物标志物开发至关重要。本文以酵母来源的d-天冬氨酸氧化酶ChDDO为研究对象，通过晶体结构解析和理性工程改造，揭示了活性位点中Arg243对底物特异性的关键作用。经定点突变和理性设计，成功构建出对d-组氨酸和d-苯丙氨酸具有高选择性且能抵抗混合底物干扰的工程变体，为发展精准的酶催化检测技术提供了新策略。
Sota Zaitsu|Daiki Imanishi|Shouji Takahashi
长冈工业大学材料科学与生物工程系，日本新潟县长冈市940-2188
选择性定量检测特定的d-氨基酸对于功能研究和生物标志物的开发至关重要。酶法检测能够方便快速地识别d-氨基酸。d-氨基酸氧化酶（DAAOs）和d-天冬氨酸氧化酶（DDOs）被广泛用于此类检测；然而，它们广泛的底物特异性限制了在混合样品中的选择性检测。在这里，我们从酵母Vanrija humicola中鉴定出了DDO底物识别的决定因素（ChDDO），并通过结构引导的工程改造改变了其底物特异性。晶体结构分析显示活性位点入口处的Arg243起着关键作用，突变分析证实替换Arg243后，该酶对d-Asp的检测活性消失，但获得了对d-His和d-Phe的检测活性。ChDDO的分子动力学模拟表明，相对于晶体样的向外取向，Arg243更倾向于采取向内朝向的构象，并伴随着局部重排，这提示了一种涉及Arg243的动态d-Asp摄取机制。以R243A为骨架，我们引入了第二位点的突变来优化底物特异性：L58N/R243A和F60Q/R243A主要通过降低d-Phe的表观kcat值来提高d-His的选择性，而H56E/R243A则主要通过降低d-His的表观kcat值并提高d-Phe的表观kcat值来增强d-Phe的选择性。这些工程改造后的变体即使在存在17种非目标d-氨基酸的混合物中也能实现d-His或d-Phe的定量检测。本研究揭示了ChDDO中可能存在的独特底物识别机制，并提供了一种基于结构的途径，将传统的DDOs转化为适用于分析和生物技术应用的定制生物催化剂。
部分内容摘录
材料
本研究中使用的所有试剂均为分析级。d-天冬氨酸由Tanabe Pharma Corporation（日本大阪）提供。d-Leu购自Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation（日本大阪），d-Ile购自Peptide Institute（日本大阪），d-His购自Tokyo Chemical Industry（日本东京）。其他d-氨基酸购自Nacalai Tesque（日本京都）或Sigma–Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。营养肉汤（NB）购自Becton, Dickinson and Company（美国富兰克林）
ChDDO中Arg243的突变分析
我们之前的研究基于ChDDO的结构模型，发现His56在催化d-Asp的过程中起重要作用（26）。在动物来源的DDOs中，位于活性位点腔顶部的Arg残基也参与了对酸性d-氨基酸的识别（37,38）。为了进一步表征ChDDO的底物结合位点，我们将其与人类DDO（hDDO）进行了比较。在hDDO的活性位点中，有七个残基：His54、Arg216、Tyr223、Tyr225、Arg237和
讨论
对单个d-氨基酸的敏感和选择性定量对于阐明它们的生理作用和生物标志物潜力至关重要。尽管酶法检测能够实现快速检测，但大多数DAAOs/DDOs具有广泛的底物特异性，这限制了在混合样品中的选择性测量。在这里，我们使用了对d-Asp具有特异性的酵母酶ChDDO作为骨架，并通过晶体结构指导对其底物偏好进行了合理改造。替换Arg243后，该酶的检测活性消失
CRediT作者贡献声明
Sota Zaitsu：撰写初稿、数据可视化、验证、方法学设计、实验设计、数据分析、概念构建。Daiki Imanishi：撰写与编辑、项目监督、数据管理。Shouji Takahashi：撰写与编辑、数据可视化、验证、项目监督、资源调配、方法学设计、实验设计、资金获取、数据分析、概念构建。
关于写作过程中生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备本手稿的过程中，作者仅使用ChatGPT（OpenAI）进行英文编辑（语法和可读性改进）。所有科学内容、解释和结论均由作者确定，作者对整个手稿负全责。
