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高温稳定酶的高通量筛选研究采用水凝胶微球结合细胞-free蛋白合成系统，解决了传统微孔板法试剂消耗大、成本高的问题。通过筛选两种不同热稳定性的漆酶（NmaL和TthL），验证了该系统的可靠性和成本效益，为定向进化工程提供新方法。
Kensei Orita|Kosuke Minamihata|Noriho Kamiya
九州大学工学研究科应用化学系，日本福冈市西区本冈744，邮编819-0395
热稳定性酶在工业应用中非常受欢迎。传统的热稳定性筛选方法通常依赖于微孔板检测；然而，随着突变位点数量的增加，库的大小呈指数级增长，这导致试剂使用量过大且成本高昂。基于小液滴的筛选系统作为一种有吸引力的替代方案应运而生，它能够减少试剂消耗并实现可扩展性。然而，构建一个能够在高温下工作的筛选系统需要对反应条件进行仔细优化。在这项研究中，我们应用了最近开发的高通量筛选系统，该系统将水凝胶珠与无细胞蛋白合成（CFPS）技术相结合，用于筛选热稳定性酶。通过使用两种具有不同热稳定性的漆酶，我们证明了基于水凝胶珠的高通量筛选系统能够可靠地根据酶的热稳定性进行区分。这些结果突显了这一平台作为一种经济高效且可扩展的基于CFPS的方法，在定向进化热稳定性酶方面的潜力。
部分内容摘录
材料
PrimeSTAR Max DNA聚合酶购自Takara Bio Inc.（日本滋贺县）。LB培养基（Miller）购自Nacalai Tesque, Inc.（日本京都）。氯化铜(II)、白蛋白、氨苄西林和过氧化氢购自Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation（日本大阪）。L-半胱氨酸和乙酸购自Kishida Chemical Co., Ltd.（日本大阪）。HEPES购自Dojindo Molecular Technologies, Inc.（日本熊本）。
漆酶的无细胞表达及辅因子掺入
最初，使用商用CFPS试剂盒（PUREfrex）表达了NmaL和TthL。每个漆酶基因片段与CFPS试剂混合后，在37°C下孵育过夜以获得无辅因子的漆酶。SDS-PAGE分析显示，每种漆酶在大约55 kDa处有蛋白质条带，证实了其在无细胞系统中的成功表达（图2A）。值得注意的是，NmaL的条带迁移位置略高于TthL的条带，这可能反映了等电点的差异（表S1）。
CRediT作者贡献声明
Kensei Orita：撰写初稿、验证、实验设计、数据分析。Kosuke Minamihata：撰写、审阅与编辑、验证、方法学设计、实验实施。Noriho Kamiya：撰写、审阅与编辑、验证、监督、方法学设计、资金获取、概念构思。
致谢
本研究得到了日本新能源产业技术开发组织（NEDO）资助的JPNP20011项目以及日本学术振兴会（JSPS）的资助（项目编号JP24K21703，资助对象为N.K.）。K.O.还获得了日本科学技术振兴机构（JST）的SPRING项目资助（项目编号JPMJSP 2136）。我们感谢On-chip Biotechnologies公司提供用于本研究的芯片液滴生成器，同时也感谢Edanz公司对本文草稿的编辑工作。
