《Journal of Bioscience and Bioengineering》：Identification of DeuA, an
Aspergillus oryzae-derived deuterolysin-like metalloprotease, as the predominant thermostable protease in soy sauce
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酱油发酵中耐热蛋白酶活性主要来源于Aspergillus oryzae的deuA基因，通过CRISPR/Cas9技术敲除pyrG、deuA、deuB基因，发现仅ΔdeuA突变体显著降低酶活性，而ΔdeuB无影响。该基因敲除不影响氮、糖等关键酿造参数，为优化工业菌株稳定性提供新靶点。
Taro Matsuoka | Ken Oda | Kazuhiro Iwashita | Jun Watanabe
Yamasa Corporation制造部门，日本千叶县潮市Araoi-cho 2-10-1，邮编288-0056
酱油中存在的耐热蛋白酶能够分解加工食品（如煮鸡蛋和鱼饼）中的蛋白质，从而导致产品质地发生不良变化。在这项研究中，我们发现来自Aspergillus oryzae的DeuA这种类似脱氢溶菌酶的金属蛋白酶是酱油发酵过程中耐热蛋白酶活性的主要来源。通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术，我们生成了deuA基因敲除突变体以及编码类似脱氢溶菌酶的deuB基因突变体，并在模拟酱油koji发酵条件的固态培养环境中评估了它们的酶活性。ΔpyrGΔdeuA菌株的耐热蛋白酶活性显著降低，在koji提取物和最终酱油中的残留活性几乎无法检测到，而deuB基因的敲除则没有显著影响。这些结果表明DeuA是酱油中耐热蛋白酶活性的主要贡献者。deuA基因的敲除并未影响其他关键酿造参数（如氮含量或糖含量），说明该基因具有作为菌株改良目标的潜力。我们的研究证实了DeuA在酱油中的重要性，并为开发具有更好工业适用性的酿造菌株奠定了基础，同时不会影响加工食品的质地稳定性。
章节摘要
菌株与培养基
使用A. oryzae RIB40（ATCC 42149）作为基因组编辑的宿主。含有2%糊精、1% Hipolypepton（Shiotani M.S.，日本兵库县）和1.5%琼脂的多肽糖（PD）琼脂培养基用于收集分生孢子，而不含琼脂的PD培养基则用于制备原生质体。敲除突变体在添加了0.1% 5-氟尿嘧啶（5-FOA）、0.5%尿苷和0.2%尿嘧啶的Czapek-Dox（CD）最小琼脂（19）培养基中维持生长。
酱油koji培养基的组成包括
通过基因组编辑生成敲除突变体
为了生成pyrG基因敲除突变体，将针对pyrG基因的sgRNA和Cas9引入A. oryzae RIB40原生质体中，然后将细胞接种到含有5-FOA的平板上。随机选取了4个耐5-FOA的菌落。后续序列分析显示，其中3个突变体在pyrG基因中存在移码突变。其中，含有11个碱基对缺失的突变体被命名为ΔpyrG，并被选为进一步分析的对象。deuA和deuB基因的敲除突变体也分别进行了相应的操作。
CRediT作者贡献声明
Taro Matsuoka：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、结果验证、方法设计、实验设计、数据分析、概念构思。Ken Oda：撰写 – 审稿与编辑、项目监督、方法设计。Kazuhiro Iwashita：撰写 – 审稿与编辑、项目监督、方法设计。Jun Watanabe：撰写 – 审稿与编辑、项目监督、项目管理、方法设计、数据管理、概念构思。
致谢
本研究未获得任何资助机构的特定资助。作者声明不存在利益冲突。
