《Journal of Bioscience and Bioengineering》：Reprogramming the flavo-encapsulin from
Thermotoga maritima to a novel protein nanocage platform for potent photodynamic therapy
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本研究成功在E. coli中重组表达并纯化泰热莫托加海棉蛋白（TmEnc），发现其内源性结合核黄素，并通过酸变性-透析重组成apo-TmEnc并重新整合外源核黄素。通过基因融合将EGFR靶向肽AEYLR修饰到TmEnc表面及开放环区，并加载罗塞棒啉作为光敏剂，构建出高效稳定的PDT纳米载体。该载体具有高光敏剂负载效率和优异的重组成效，为光动力治疗提供新型纳米平台。
中村龙太郎（Ryutaro Nakamura）| 野中守（Mamoru Nonaka）| 中村文彦（Fumihiko Nakamura）| 铃木武弘（Takehiro Suzuki）| 土前直志（Naoshi Dohmae）| 松村宏敏（Hirotoshi Matsumura）| 小田雅文（Masafumi Odaka）
日本秋田县秋田市手形学园町1-1，秋田大学工程科学研究生院，邮编010-8502
囊蛋白（Encapsulins）是由单一单体蛋白构成的纳米笼结构，由于其易于生产和出色的稳定性，作为多种生物纳米工具的平台而备受关注。我们发现，在大肠杆菌（Escherichia coli）中重组表达的Thermotoga maritima囊蛋白（TmEnc）天然含有核黄素，这一结论通过LC-MS分析得到了证实。通过在中性pH条件下变性囊蛋白，随后在中性pH条件下进行透析处理，我们获得了无核黄素的TmEnc，并通过外源性添加核黄素将其重新组装。为了将TmEnc纳米笼用于生物医学应用，我们通过将其C末端或暴露的环区与EGFR靶向肽AEYLR进行基因融合，使其表面能够结合该肽。此外，我们在重组过程中将光敏剂罗丹明（rose bengal）装载到TmEnc中，使其具备光动力疗法（PDT）的功能。结果表明，装载了罗丹明的AEYLR修饰TmEnc对过度表达EGFR的癌细胞表现出显著的光细胞毒性。鉴于其高效的罗丹明装载能力和优异的重组产率，这种去除了核黄素、并重新组装了光敏剂的TmEnc纳米笼成为一种有前景且经济高效的光动力疗法平台。
部分内容摘录
质粒构建
Thermotoga maritima的囊蛋白基因含有< /> I和< /> I限制性位点，经过密码子优化后适用于大肠杆菌（E. coli）表达，该基因由Eurofins Genomics Inc.（日本东京）定制合成。含有TmEnc基因的pTAKN-2质粒使用大肠杆菌DH5α菌株（Takara Bio，日本滋贺县）进行扩增。扩增后的TmEnc基因经过< /> I和< /> I酶切后，被插入pET23b质粒的< /> I-< /> I位点，从而实现与C末端6个His标签的融合表达。
核黄素分子的分离与鉴定
纯化的TmEnc的紫外-可见光吸收光谱在375 nm和445 nm处显示出两个明显的峰。经二硫苏糖醇还原处理后，这两个峰消失，同时在420 nm附近出现一个宽峰（图S1）。这些光谱特征符合核黄素的特性。为了鉴定这种类似核黄素的分子，我们用TFA沉淀TmEnc，随后通过反相高效液相色谱（reverse-phase HPLC）分析上清液。从TmEnc中分离出的化合物的洗脱时间为8.5分钟。
讨论
囊蛋白具有多种优异的特性，使其成为纳米生物技术应用中的理想纳米笼平台：(i) TmEnc可以在大肠杆菌中轻松过表达并自组装，每升培养液可产生约40毫克的蛋白质；(ii) 该纳米笼结构可在酸性pH条件下变性，随后通过中性pH缓冲液透析重新组装，在此过程中可以装载目标分子和蛋白质。
CRediT作者贡献声明
中村龙太郎（Ryutaro Nakamura）：撰写初稿、数据可视化、验证、方法设计、实验研究、数据分析、数据整理。野中守（Mamoru Nonaka）：方法设计、实验研究、数据分析。中村文彦（Fumihiko Nakamura）：方法设计、实验研究、数据分析。铃木武弘（Takehiro Suzuki）：方法设计、实验研究、数据分析、数据整理。土前直志（Naoshi Dohmae）：方法设计、实验研究、数据分析、数据整理。松村宏敏（Hirotoshi Matsumura）：撰写修订稿、验证、项目管理、资金协调。
致谢
我们感谢秋田大学工程科学研究生院的川添香奈（Kanan Kawazoe）女士提供的技术支持。本研究部分得到了日本学术振兴会（JSPS）科学研究费（C类资助）（项目编号：18K11691）的支持。作者们还感谢Enago公司对本文的英文审稿帮助。
