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微生物合成高产量ergothioneine的策略研究。通过工程改造大肠杆菌，整合甲基转移酶进化、代谢途径组合优化、转录翻译调控及SAM供应增强策略，实现ERG产量达12161 mg/L，创微生物发酵最高记录。
张路文|唐家伟|杨松柏|冯美清|陈少新
复旦大学上海免疫治疗工程研究中心药学科学院，上海201203，中国
摘要
麦角硫因（ERG）是一种天然含硫化合物，来源于组氨酸，以其显著的抗氧化特性而闻名。由于其可持续性和可扩展性，微生物合成ERG引起了广泛关注。尽管已经尝试构建工程菌株，但ERG的产量仍然较低。在本研究中，通过一系列代谢工程策略对大肠杆菌（Escherichia coli）进行了改造，以实现高产量的ERG生产。通过随机突变和筛选，鉴定出一种具有较高催化活性的甲基转移酶，并获得了其进化变体，该变体的催化活性提高了1.4倍。随后，通过将多种亚砜合成酶和C-S裂解酶与进化后的甲基转移酶结合，进行了组合途径工程改造，最终获得了一种ERG产量为297 ± 3 mg/L的菌株。为了进一步提高途径效率，创新性地采用了核糖体结合位点和启动子工程来微调ERG合成途径中关键酶的表达水平。此外，通过辅因子工程增强了必需的甲基供体S-腺苷甲硫氨酸的供应。最终获得了一种高产ERG的菌株S5，其ERG产量达到了453 ± 9 mg/L。在5升发酵罐中进行扩大生产实验时，菌株S5在144小时内产生了12161 ± 311 mg/L的ERG，这代表了迄今为止微生物发酵中取得的最高产量。这项工作证明了多种代谢工程策略协同应用在提高产品产量方面的有效性，为ERG的成本效益生物合成奠定了基础。
引言
麦角硫因（ERG）是一种天然的含硫组氨酸衍生物，由某些细菌和真菌（如Mycobacterium smegmatis、Methylobacterium brachiatum、Neurospora crassa等）自然合成（Arslan等人，2023年；Fujitani等人，2018年；Lei等人，2025年；Seebeck，2010年）。ERG具有显著的抗氧化特性和多种生物活性，包括抵抗紫外线损伤、抗炎作用以及高效的自由基清除能力（Franzoni等人，2006年；Hseu等人，2020年；Liu等人，2020年）。越来越多的证据表明，ERG具有细胞保护作用，并与降低与年龄相关的疾病风险有关，突显了其潜在的生理重要性（Apparoo等人，2022年；Duan等人，2023年；Gao等人，2025年；Zhang等人，2025a）。人类无法自身合成ERG，完全依赖饮食摄入（Gründemann等人，2005年）。因此，ERG作为食品、制药和化妆品领域中有前景的营养保健品和功能性成分受到了越来越多的关注，市场需求也在稳步增长（Gründemann等人，2005年；Lei等人，2025年）。
目前，ERG可以通过天然提取、化学合成和微生物合成获得。然而，化学合成和天然提取方法通常受到高生产成本、操作复杂性和可扩展性限制（Cremades等人，2015年；Khonde和Jardine，2015年；Lei等人，2025年）。相比之下，微生物合成可以在温和条件下使用可再生原料生产ERG，为大规模生产提供了可持续且可扩展的替代方案。
天然ERG的合成途径可分为厌氧途径和好氧途径。好氧途径包括原核途径（EgtABCDE）和真核途径（Egt1、Egt2）（图1A）。原核途径的初始步骤是将l-组氨酸和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）转化为赫辛碱（HER），该过程由EgtD催化。然后，EgtB催化γ-谷氨酰半胱氨酸和HER生成赫辛酰-γ-谷氨酰半胱氨酸亚砜，随后由谷氨酰胺氨转移酶（EgtC）和吡哆醛5-磷酸（PLP）依赖的裂解酶（EgtE）进一步催化生成ERG（Seebeck，2010年）。相比之下，真核途径采用更简洁的途径，其中半胱氨酸直接作为硫供体，这使其特别适合进行代谢工程改造（Hu等人，2014年）。
基于对ERG合成途径的阐明，已在多种微生物宿主中成功实现了ERG的异源生产，包括大肠杆菌（Escherichia coli）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、Yarrowia lipolytica等（表S1）（Fujitani等人，2018年；Tanaka等人，2019年；van der Hoek等人，2019年；van der Hoek等人，2022年；Zhang等人，2024年）。在这些宿主中，大肠杆菌因其快速生长、成熟的遗传背景和高产性而受到特别关注。为了提高ERG的产量，人们探索了多种代谢工程策略，包括途径挖掘和重构、关键酶的蛋白质工程以及前体供应的增强。例如，Zhang等人主要通过关键途径酶的蛋白质工程提高了ERG产量，而Yan等人则通过加强甲基和硫供应系统实现了高效的ERG合成（Yan等人，2025年）。此外，Kang等人结合蛋白质工程和宿主改造来提高ERG的产量（Kang等人，2025年）（表S1）。尽管这些努力提高了ERG产量，但迄今为止报道的产量和平均生产力仍不足以满足工业应用的需求。当前工程策略中存在的一些共同问题可能限制了进一步的改进。首先，ERG合成途径主要使用来自有限种类生物体的酶进行组装，主要是Mycobacterium smegmatis、Neurospora crassa和Trichoderma reesei（Yan等人，2025年；Zhang等人，2024年；Zhang等人，2025b）。特别是在催化ERG合成初始步骤的组氨酸甲基转移酶方面，这可能限制了催化活性并影响整个途径的效率。此外，大多数研究主要集中在提高途径酶的表达水平或催化活性上，主要是通过基因剂量增加或蛋白质工程来实现（Kang等人，2025年；Liu等人，2024年；Zhang等人，2023年）。相比之下，很少有研究关注协调ERG合成途径中多种酶的表达，而这对于提高整体途径效率和代谢通量分布至关重要（Li等人，2024年；Li等人，2019年；Xia等人，2025年）。此外，这些工程策略通常以有限的组合形式应用，同时考虑酶、合成途径和宿主代谢的全面优化框架尚未得到充分探索。
为了解决这些问题，本研究采用了多层次的代谢工程策略来高效合成ERG，包括酶的筛选和工程改造、途径的组装和优化以及前体供应的增强。值得注意的是，通过启动子和核糖体结合位点（RBS）工程在转录和翻译水平上调控酶的表达，从而实现了ERG合成途径中酶表达的平衡。与基因拷贝数扩增或强表达策略相比，这种方法能够精确调控途径通量，同时最小化不必要的代谢负担。通过整合这些策略，获得了一种高产ERG的菌株，其产量达到了迄今为止微生物发酵中报道的最高水平（表S1）。这项工作不仅建立了一个高效的微生物细胞工厂用于ERG生产，还为提高ERG产量提供了新的思路。
部分摘录
化学品、质粒和菌株
HER标准品（≥98%）和S-腺苷-L-甲硫氨酸1,4-丁二磺酸盐购自Bide Pharmatech有限公司（中国上海）。除非另有说明，本研究中使用的其他化学品均为分析级。
质粒pETDuet-1、pACYCDuet-1、pCDFDuet-1和pRSFDuet-1用于基因过表达。编码甲硫氨酸腺苷转移酶（MetKE56N/Q105R、ScSAM、MJSAM）、组氨酸甲基转移酶（EgtD同源物）、亚砜酶（EgtB/Egt1同源物）的基因被用于表达。
为ERG合成挖掘和改造组氨酸甲基转移酶
赫辛碱（HER）是ERG合成中的关键中间体，由组氨酸甲基转移酶（EC 2.1.1.44）催化的N-α-三甲酰化作用生成。HER的合成是所有报道的ERG合成途径中的第一个且保守的步骤，它是ERG合成途径中的主要流量控制节点（图1A）。因此，组氨酸甲基转移酶的催化性能对整体效率起着决定性作用。
结论
在本研究中，我们通过筛选和改造新型酶构建了一条高效的ERG合成途径，并通过启动子和RBS工程进一步优化了该途径。然后，通过改造宿主菌株增强了SAM的供应，得到了工程菌株S5。在5升生物反应器中进行分批培养实验时，菌株S5在144小时内产生了12161 ± 311 mg/L的ERG，这代表了迄今为止微生物细胞工厂中报道的最高产量和生产力。
CRediT作者贡献声明
冯美清：撰写 – 审稿与编辑。杨松柏：撰写 – 审稿与编辑。陈少新：监督、资金获取。唐家伟：撰写 – 审稿与编辑、资金获取。张路文：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、验证、软件使用、方法学设计、数据分析、概念化。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了上海帆船计划（23YF1445800）和上海前沿与跨学科技术领域关键技术研发计划（25JC3201500）的支持。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
