编辑推荐：
本研究通过计算设计开发三种不同长度的连接肽，将CSGal-1单体共价连接成单链结构。实验证明最长酸性连接肽（14aa）的scCSGal-1表达量最高、溶解性最佳且能高效折叠。与天然二聚体相比，单链结构在溶血活性、结合特异性及热力学稳定性方面无显著差异，验证了计算设计连接肽的有效性。
Dajana Kolanovic|Markus Braun|Rajeev Pasupuleti|Georg Mlynek|Jakob Wallner|Gustav Oberdorfer|Birgit Wiltschi
acib – 奥地利工业生物技术中心，Petersgasse 14，8010 格拉茨，奥地利
摘要
基于半乳凝集素-1（galectin-1）的疗法开发面临着该凝集素特有的挑战，例如其不同的氧化还原状态和可逆的单体-二聚体平衡。通过生成不含半胱氨酸的半乳凝集素-1突变体（CSGal-1），稳定了其氧化还原行为；而通过构建共价连接的半乳凝集素-1二聚体，则避免了其浓度依赖性的单体-二聚体平衡问题。然而，连接器的类型和长度可能会影响共价构建体的治疗效力、蛋白质浓度、溶解度、结构折叠或生物活性。因此，设计具有所需特性和可预测行为的连接器至关重要。
在这项研究中，我们从头设计了三种不同的连接器来共价连接CSGal-1的两个亚基。这些CSGal-1亚基通过设计的连接器在基因上被融合，并首次以单链（sc）蛋白的形式表达。数据显示，使用最长且最酸性的连接器构建的scCSGal-1表现出最高的表达水平、溶解度，甚至能够从包涵体中重新折叠，这与计算机模拟预测的结果一致。此外，我们还对比了scCSGal-1与非共价二聚体CSGal-1的性能。差示扫描荧光法（differential scanning fluorimetry）和等温滴定量热法（isothermal titration calorimetry）的数据表明，scCSGal-1保持了其功能，其结合亲和力和热力学特性与非共价二聚体CSGal-1相似。这些发现强调了计算方法在连接器设计中的有效性，并鼓励将其扩展到其他需要稳定二聚体形式的凝集素。
引言
许多重要的细胞过程，如分化、迁移、增殖、成熟或凋亡，都受到半乳凝集素（galectins）的调控（Rabinovich和Toscano，2009年；Elola等人，2007年；Hernandez和Baum，2002年）。半乳凝集素是一类动物凝集素，至少包含一个保守的碳水化合物识别结构域（CRD），对β-半乳糖苷具有亲和力（Barondes等人，1994年）。根据CRD的排列及其结构特征，半乳凝集素被分为三个不同的亚家族。原型半乳凝集素含有一个CRD，并在溶液中非共价地形成二聚体。嵌合型半乳凝集素在C端具有一个CRD，N端有一个非凝集素尾部，用于寡聚化。串联重复（TR）半乳凝集素由两个通过不同长度的肽连接器连接的CRD组成（Cooper，2002年；Kasai和Hirabayashi，1996年）。在半乳凝集素-1中，寡聚化和多价性的形成尤为重要，它是原型亚家族的成员。
半乳凝集素-1参与多种细胞活动，在调节免疫系统中起着重要作用（Camby等人，2006年；He和Baum，2006年；Liu等人，2002年）。半乳凝集素-1主要通过选择性诱导活化T细胞的凋亡来发挥免疫抑制作用，因此成为治疗自身免疫和炎症性疾病的潜在分子（Rabinovich等人，1999年；Blaser等人，1998年；Offner等人，1990年）。对于大多数生理功能，包括诱导凋亡，需要半乳凝集素-1的二聚体形式（Giudicelli等人，1997年；Perillo等人，1995年）。然而，半乳凝集素-1以单体和二聚体两种形式存在，并处于一个可逆的平衡状态，解离常数（Kd）约为7?μM（Cho和Cummings，1995年）。这意味着需要高浓度的半乳凝集素-1才能形成活性二聚体。由于潜在的副作用，这种高剂量在人类治疗中并不实用（Rabinovich等人，1999年）。此外，多项研究表明，与原型半乳凝集素相比，TR型半乳凝集素具有更高的信号传导效力，这归因于其内在的双价性（Bi等人，2008年；Levy等人，2006年）。此外，半乳凝集素-1的可逆单体-二聚体平衡使其与其他凝集素的共轭变得复杂，因为需要使用生物正交的反应性非典型氨基酸（Tobola等人，2019年）。这种策略可以生成具有异质配体特异性的串联半乳凝集素。然而，溶液中同时存在单体和二聚体形式的半乳凝集素会导致混合物的异质性，从而难以获得一致且可预测的寡聚状态。
为了解决半乳凝集素-1的可逆平衡问题，一些研究小组通过肽连接器将其亚基基因融合，生成了单链半乳凝集素-1变体。例如，B?ttig等人（2004年）使用甘氨酸-甘氨酸（GG）连接器将两个半乳凝集素-1亚基融合在一起。这种共价二聚化的半乳凝集素-1在较低浓度下就能诱导凋亡，这一发现得到了其他使用不同肽连接器连接的双价单链半乳凝集素-1构建体的验证（Vértesy等人，2015年；Zhang等人，2015年；Earl等人，2011年；Bi等人，2008年）。然而，内在的双价性并不是这些构建体效力的唯一因素。当两个半乳凝集素-1亚基通过TR型半乳凝集素9的14个氨基酸（aa）柔性连接器连接时，融合诱导的凋亡效果比使用短而刚性的GG连接器更强（Bi等人，2008年）。此外，使用来自细菌核糖体L9蛋白的34个氨基酸（aa）刚性α-螺旋连接器连接的双价半乳凝集素-1构建体，其效力也高于使用GG连接器的半乳凝集素-1（Earl等人，2011年）。Zhang等人（2015年）使用不同长度的连接器（从短GG连接器到TR型半乳凝集素-4和-8中的长连接器）共价连接了两个半乳凝集素-1单体，发现所有双价单链半乳凝集素-1构建体的效力都高于天然二聚体半乳凝集素-1。他们的研究表明，连接器的类型会影响效力，例如较长的连接器能进一步提高双价构建体的效力（Zhang等人，2015年）。如上述研究所示，共价二聚体半乳凝集素-1的效力增强取决于其两个CRD的存在及其正确的取向，而这又取决于连接器的长度。另一方面，连接器域会影响蛋白质的整体结构，从而影响其溶解度、稳定性、结合亲和力、特异性和功能（Arslan等人，2022年；Kutzner等人，2019年；Xiao等人，2018年；Vértesy等人，2015年）。因此，选择合适的连接器对于确保蛋白质构建体的预期性能至关重要。迄今为止，用于双价半乳凝集素-1构建体的肽连接器仅限于来自TR型半乳凝集素或其他生物体的天然连接器以及常用的GG和GS连接器。然而，天然连接器可能并不总是能为特定应用提供最佳性能，通常需要大量的实验优化，这使得选择过程耗时（van Rosmalen等人，2017年）。相比之下，计算方法能够精确调整连接器的灵活性、长度和构象，以满足特定生物分子结构的需求。这种方法简化了最佳连接器序列的识别，显著减少了实验筛选所需的时间和成本。鉴于这些优势以及之前在选择双价半乳凝集素-1连接器时遇到的限制，需要更合理和少依赖经验的连接器设计和选择策略。这促使我们研究从头设计的连接器是否有助于生产稳定且具有生物活性的单链半乳凝集素-1，从而证明计算优化连接器工程的可能性。
将半乳凝集素-1用作治疗剂不仅因其单体-二聚体平衡而具有挑战性，还因其氧化还原状态相关的问题。半乳凝集素-1的CRD中有六个半胱氨酸残基，在氧化环境中可以形成二硫键：氧化形式的半乳凝集素-1没有凝集素活性，表现为完全不同的蛋白质（Kadoya和Horie，2005年；Pande等人，2003年；Kasai和Hirabayashi，1996年）。由于添加还原剂可能在细胞研究中产生不良影响，因此开发了一种所有六个半胱氨酸都被突变为丝氨酸的半乳凝集素-1修饰形式。不含半胱氨酸的突变体（CSGal-1）在储存过程中表现出更高的稳定性，并且在没有还原剂的情况下仍保持其凝集素活性（Nishi等人，2008年）。此外，CSGal-1可以防止在涉及硫醇-马来酰亚胺反应的生物共轭过程中形成异质混合物（Walsh等人，2021年；McDonagh等人，2006年）。然而，在基于‘点击化学’的生物共轭中使用含有位点特异性反应性非天然氨基酸（ncAA）的CSGal-1非共价二聚体也可能导致混合物的异质性（Tobola等人，2019年）。为了解决这个问题，设计单链CSGal-1变体可以在定义的位置引入单个反应性ncAA，因为其亚基是通过连接器融合的。这种方法可以确保共轭产物的均匀性，这在治疗应用中具有潜在价值，例如开发半乳凝集素-1-药物缀合物或用于定向固定（如我们之前的研究所示，Kolanovic等人，2024年）。据我们所知，CSGal-1尚未被制备成单链形式，例如通过使用（计算设计的）连接器将其亚基融合。因此，它成为我们研究的理想概念验证分子。
为此，我们使用Rosetta设计了三种长度和氨基酸序列不同的连接器。通过引入9个、11个和14个氨基酸的连接器，我们在大肠杆菌中制备了三种共价连接的CSGal-1单链（sc）构建体。具有最长连接器的sc构建体在产量、溶解度和折叠方面优于其他两种构建体，这与计算模型的预测一致。我们进一步研究了连接器区域如何影响单链构建体的性质，与其非共价二聚体形式相比。数据显示，scCSGal-1具有更高的稳定性，并保持了结构和功能完整性。这表明计算方法可以有效地预测连接器的性能，并以更可预测和理想的方式制备单链构建体，优于经验方法。
章节片段
使用Rosetta设计单链CSGal-1
β-链配对和界面处的疏水相互作用驱动了天然CSGal-1二聚体的形成。理想的共价连接器应在基因水平上编码，将第一个单体的C端连接到下一个单体的N端。这样可以保持天然界面，避免暴露潜在的疏水区域，从而限制连接构建体形成不希望的二聚体状态。
结论
在这项研究中，我们通过将半乳凝集素-1的亚基与计算设计的连接器基因融合，成功制备出了功能性单链构建体。过去20年中，虽然开发了许多不同的单链半乳凝集素-1构建体，但主要使用了天然存在的连接器。然而，这种方法主要是基于经验的和直观的，存在一定的不确定性。连接器的插入可能导致不可预测的问题。
使用Rosetta对scCSGal-1d1-3进行建模
使用Rosetta设计软件预测了scCSGal-1d1-3的结构（图1）。首先使用提供的bash脚本和CSGal1的结构生成了blueprint文件。然后修改blueprint文件，包含报告的连接器长度和二级结构。接着使用RosettaRemodel对序列进行循环置换，并通过片段插入添加连接器残基，随后对主链和侧链进行能量最小化。
未引用的参考文献
(Patterson和Wang，2002年；Rabinovich等人，1999年；van den Noort等人，2021年)
CRediT作者贡献声明
Markus Braun：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化、验证、软件、方法学、研究、形式分析、数据管理、概念化。Dajana Kolanovic：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化、验证、方法学、研究、形式分析、数据管理、概念化。Birgit Wiltschi：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、监督、资源管理、项目管理、资金提供
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
该项目synBIOcarb获得了欧盟Horizon 2020研究与创新计划下的Marie Sk?odowska-Curie资助协议（编号814029）的支持。COMET中心acib：下一代生物生产项目由BMK、BMAW、SFG、Tirol地区机构、下奥地利州政府和维也纳商业机构在COMET - 优秀技术能力中心框架内资助。COMET资助计划由奥地利研究促进机构FFG管理（FFG K2
