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本研究利用黑曲霉M13菌株开发了一种整细胞生物催化系统，通过优化条件实现了HMF到BHMF的高效选择性还原。最佳条件下转化率达100%，产率达84.1%，并提出了细胞再生策略延长催化寿命。转录组分析揭示了关键酶基因的上调，为工程菌株设计提供依据。该系统符合绿色化学原则，为可持续生物精炼提供新方案。
张宏丽|尹金宝|刘彦青|张璐瑶|刘福强|吴静|张建安
太原师范学院化学与材料学院，中国晋中030619
摘要
将5-羟甲基呋喃（HMF）这种源自木质纤维素生物质的关键平台化学品转化为2,5-双（羟甲基）呋喃（BHMF）等高附加值产品，对于可持续的生物炼制工艺具有重要意义。在本研究中，我们开发了一种使用黑曲霉M13的全细胞生物催化系统，用于选择性地将HMF还原为BHMF。通过系统优化，我们确定了一种仅由无菌水和葡萄糖组成的最小反应介质。在培养72小时后收获的细胞以120 mg/mL的浓度使用时，获得了最高的催化活性，在12小时内实现了100%的HMF转化率和84.1%的BHMF产率。采用 fed-batch 和 sequential-batch 方式可以实现连续的BHMF生产，这些细胞在重复批次模式下可重复使用21次，平均BHMF产率为76.8%。此外，失活细胞的再生使催化寿命延长了43%。在HMF胁迫下的转录组分析显示，几种氧化还原酶基因（包括醇脱氢酶和醛脱氢酶）显著上调，为未来的菌株工程提供了遗传靶点。基于黑曲霉M13的系统在温和条件下运行，所需成分简单，符合绿色化学原则，为将生物质衍生的HMF升级为有价值的呋喃化合物提供了一个高效且可持续的生物催化平台。
引言
近年来，化石燃料的不断消耗和环境污染的加剧，加剧了人们对利用绿色可再生资源（尤其是木质纤维素生物质）的研究兴趣。将木质纤维素资源转化为生物基平台化合物和生物燃料是生物质高值转化的关键领域。在生物炼制过程中，HMF作为关键中间体，将生物质原料与能源和化学工程联系起来。HMF通过己糖脱水反应生成（Yu和Tsang，2017），是一种多功能化学中间体，含有活性醛基和碳-碳双键，使其能够通过氧化和氢化等反应转化为各种高附加值化学品（Román-Leshkov等人，2006）。值得注意的是，通过选择性氢化HMF的醛基合成的BHMF是一种多功能二醇，对于精细化学品合成（Goswami等人，2008）、新型功能化聚醚（Majdoub等人，1996）、聚氨酯（Tillet等人，2011）以及制药中的多功能杂环化合物（Cottier等人，2003）至关重要。
化学方法常用于将HMF催化转化为呋喃类芳香化合物，通常涉及氢或醇作为氢供体以及高温下的金属催化剂，还需要有机溶剂（Zhang等人，2019）。这些化学方法需要专门的生产设备，并且伴随着严苛的反应条件和严重的环境污染（Du等人，2023）。相比之下，全细胞生物催化作为一种替代方案，具有高选择性、温和的反应条件、环保性和优异的选择性，更符合绿色化学原则和可持续发展目标（Cunha等人，2025）。
HMF生物催化中的一个重大挑战是对微生物细胞的强毒性。虽然传统发酵中的微生物可以代谢或将少量HMF转化为毒性较低的物质，但较高浓度会导致细胞死亡（Wu等人，2013）。因此，用于生产HMF衍生物的全细胞生物催化系统需要同时具有高HMF耐受性和强催化效率的微生物。为此目的，已经鉴定并工程化了多种催化菌株。例如，Li等人（2017）报道，在100 mM葡萄糖（作为共底物）的存在下，Meyerozyma guilliermondii SC1103可以在12小时内选择性地将100 mM HMF还原为BHMF，产率为86%。同样，Burkholderia contaminans NJPI-15在70 mM谷氨酰胺和30 mM蔗糖的存在下也能将100 mM HMF转化为BHMF，产率为95%。采用 fed-batch 方式，在48小时内获得了656 mM的BHMF，产率为93.7%（Chang等人，2021）。其他菌株，包括Bacillus subtilis HA70（Xia等人，2023）、Aureobasidium subglaciale F134（Chen等人，2021）、Scheffersomyces stipitis KCTC 7228（Ra等人，2013）、Escherichia coli CCZU-K14（He等人，2018）和重组Saccharomyces cerevisiae（Xia等人，2020），也显示出将HMF还原为BHMF的有效性。尽管取得了这些进展，HMF的全细胞生物催化转化仍面临几个障碍：（1）催化系统的复杂性，不仅需要微生物细胞和HMF，还需要共底物、pH缓冲剂（如磷酸盐）、氨基酸、金属离子和其他营养物质；（2）微生物细胞的相对较短催化寿命，这给细胞回收和再生带来了困难；（3）调控细胞内HMF催化转化的关键基因尚未完全阐明。
本研究探讨了使用黑曲霉（A. niger）M13进行HMF向BHMF的催化转化，该菌株此前在我们实验室中被发现对木质纤维素稀酸水解物中的抑制剂具有高耐受性，并且能够代谢呋喃和HMF（Yin等人，2023）。研究了营养物质、细胞浓度和细胞成熟度对催化效率的影响，以确定最佳催化条件。还研究了在 fed-batch 和重复批次催化策略下的细胞催化效率和寿命。此外，进行了转录组分析，以鉴定关键基因，为通过基因工程增强HMF的生物催化提供潜在靶点。这项工作为HMF的绿色生物催化转化提供了一个有前景且环境友好的工具。
菌株信息
A. niger M13（CGMCC编号41010）由我们实验室分离并保存。
PDA斜面培养基
PDA斜面培养基（北京Solarbio科技有限公司提供）用于培养A. niger M13孢子。制备方法是将4.6克培养基溶解在100毫升水中并加热至沸腾，然后将其倒入18厘米的试管中，后在121°C下高压灭菌20分钟，最后在15°斜面上冷却固化。A. niger M13对HMF的代谢途径
尽管能够转化和利用HMF的微生物种类多样，但它们对HMF的氧化代谢途径存在相似性（Wu等人，2016）。如图1所示，HMF首先被氧化为HMFCA或还原为BHMF。HMF还原为BHMF是一个可逆反应。由于不同微生物中的酶及其活性存在差异，BHMF可以再次被氧化回HMF，然后再进一步转化为HMFCA。
结论
本研究开发了一种高效且简单的全细胞生物催化系统，使用A. niger M13选择性地将HMF转化为BHMF。通过系统优化催化条件，确定了一种仅由无菌水和葡萄糖组成的最小反应介质。这种简化系统优于传统的含有磷酸盐缓冲剂和其他营养物质的系统，同时降低了操作复杂性和成本，而不影响催化性能。
CRediT作者贡献声明
刘福强：验证、方法学、实验研究。
张璐瑶：验证、方法学。
张建安：监督、资金获取。
吴静：写作 – 审稿与编辑、项目管理、资金获取。
张宏丽：写作 – 审稿与编辑、初稿撰写、验证、方法学、实验研究、数据分析。
刘彦青：验证、方法学。
尹金宝：验证、方法学、数据管理。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了山西省基础研究计划（自由探索项目，项目编号20210302124464）和清华大学的项目（项目编号RH2100001380、RH2400001651）的支持。
