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本研究针对间充质基质细胞胞外囊泡(MSC-EVs)作为治疗剂在临床应用时面临的供体异质性、细胞复制寿命有限及表型不稳定等规模化生产瓶颈，探讨了利用人端粒酶逆转录酶(hTERT)永生化MSCs作为EV生产细胞源的可行性。研究发现，hTERT永生化（端粒酶化）的沃顿胶来源MSCs(WJ-MSCs)在保持细胞形态、表面标志物谱及成骨、成脂、成软骨三系分化能力的同时，实现了无限、稳定的体外增殖。更重要的是，来源于永生化MSCs的EVs在大小、数量、货物组成（包括miRNA和蛋白质）以及抗炎、抗纤维化和促伤口愈合的生物学活性方面，与其原代MSCs来源的EVs相比均无显著差异。这表明，对单一供体来源的细胞进行端粒酶化，是构建可标准化、规模化生产功能一致性MSC-EVs的“细胞工厂”的一种极具前景的策略。
在再生医学的广阔天地里，间充质基质细胞(Mesenchymal Stromal Cells, MSCs)犹如一颗璀璨的明星，因其强大的抗炎、免疫调节和组织修复能力，在众多疾病模型中展现出巨大的治疗潜力。然而，科学家们逐渐发现，这些细胞“本尊”的许多神奇功效，很可能是通过它们分泌的、被称为“胞外囊泡”(Extracellular Vesicles, EVs)的微小“包裹”来间接实现的。这些纳米级的囊泡携带着蛋白质、RNA等生物活性“货物”，穿梭于细胞之间传递信息，模拟了亲本MSCs的治疗作用，却规避了细胞疗法潜在的致瘤和免疫排斥风险，使得MSC-EVs被视为新一代无细胞治疗剂。
尽管如此，从实验室走向病床的道路上，MSC-EVs面临着一道关键的“量产”难关。传统的MSCs来源于不同供体，存在难以避免的个体差异，导致其分泌的EVs在“货物”组成和功能上“千人千面”，难以保证批次间的稳定性和疗效的可重复性。更棘手的是，MSCs在体外培养时会逐渐衰老，增殖能力有限，无法满足临床治疗所需的海量EVs生产需求。长期以来，如何获得一个能够无限增殖、同时又保持“本真”特性、并能持续生产高质量EVs的稳定细胞来源，是领域内亟待破解的难题。
为此，研究人员将目光投向了一种经典的细胞工程技术——端粒酶永生化。端粒是染色体末端的“保护帽”，随着细胞分裂会逐渐缩短，导致细胞衰老。人端粒酶逆转录酶(human Telomerase Reverse Transcriptase, hTERT)能够修复端粒，从而赋予细胞无限增殖的潜力。那么，一个核心问题产生了：利用hTERT让MSCs获得“永生”的能力，会不会“改变”这些细胞的本质，进而让它们生产的“治疗包裹”EVs也“变质”呢？这项发表在《Journal of Biotechnology》上的研究，正是为了系统性地回答这个问题。
为了探究hTERT永生化对MSCs及其EVs的影响，研究者们设计了一项严谨的对比研究。他们从单一供体的沃顿胶(Wharton's Jelly)中分离出原代MSCs(WJ-MSC273)，并通过电转染hTERT基因，建立了永生化细胞系(WJ-MSC/TERT273)。研究的关键在于，从细胞自身特性到其分泌的EVs，进行全方位、多维度的“找不同”比较。
研究者们运用了一系列关键技术来刻画细胞和EVs的特征。在细胞层面，他们通过细胞形态观察、生长曲线绘制、群体倍增数计算来评估增殖能力；使用流式细胞术检测MSCs的表面标志物（CD105、CD73、CD90阳性，CD34阴性）；通过诱导分化（成骨、成脂、成软骨）及特异性染色（如茜素红、油红O、阿利新蓝）结合定量PCR，评估其多向分化潜能；还进行了核型分析、衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色和软琼脂克隆形成实验，以评估遗传稳定性和潜在致瘤性。在EVs层面，他们采用切向流过滤(Tangential Flow Filtration, TFF)技术富集EVs，使用纳米颗粒追踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis, NTA)测定EVs的浓度和粒径，通过蛋白质印迹法(Western Blot)和流式细胞术检测EVs的标志蛋白（如CD9、CD63、CD81、TSG101），并利用透射电镜(Transmission Electron Microscopy, TEM)观察其形态。为了深入剖析EVs的“货物”，研究进行了小RNA测序(miRNAome profiling)和蛋白质组学(proteomics)分析。最后，通过三种细胞功能实验（LPS刺激的巨噬细胞抗炎实验、TGF-β1诱导的皮肤成纤维细胞抗纤维化实验、内皮细胞划痕愈合实验）来评估EVs的生物学活性。
研究结果
3.1. hTERT介导的永生化不影响沃顿胶间充质基质细胞的形态和生长特性
研究发现，永生化WJ-MSCs在长达110个群体倍增(PDs)的培养中，始终保持了与原代细胞相似的纺锤形形态和快速的增殖速率（倍增时间约14小时），而原代细胞在约65个PD后开始衰老，出现细胞扁平、增大等典型形态，增殖停滞。永生化细胞的端粒酶活性显著升高，而原代细胞仅检测到微量活性。核型分析显示两者均为正常的46, XX核型。这些结果表明，hTERT过表达成功赋予了细胞无限增殖能力，且未引起明显的形态改变或染色体异常。
3.2. hTERT介导的永生化不影响沃顿胶间充质基质细胞的功能特性
流式分析证实，永生化细胞与原代细胞一样，高表达MSCs特征性表面标志物CD105、CD73和CD90，不表达CD34。在分化潜能上，永生化细胞同样展现出强大的成骨、成脂和成软骨能力，其分化产物的量化指标（如钙结节染色、脂滴形成）与原代细胞无显著差异。即使在远超原代细胞寿命的传代后（如PD 104），永生化细胞仍能有效地分化为成骨细胞。这表明hTERT永生化并未损害MSCs的核心身份标识和多功能性。
3.3. 原代与永生化WJ-MSC来源EVs的特征比较
对细胞条件培养基进行TFF富集后，NTA分析显示，两者产生的EVs在浓度、粒径分布（主要位于100-200 nm）以及每个细胞每天的颗粒产率（约1.1×104- 1.7×104颗粒/细胞/天）上均高度相似。TEM观察证实了典型的杯状囊泡形态。通过蛋白质印迹法和多重流式检测，两者EVs都富集了经典的四跨膜蛋白标志物（CD9、CD63、CD81）和EV相关蛋白（TSG101、Syntenin-1），且均不含内质网标志物Calnexin。表面蛋白谱分析也显示高度重叠的图谱。这些数据表明，hTERT永生化并未改变MSCs分泌EVs的基本物理特性和表面蛋白标志物谱。
3.4. 小RNA和蛋白质组学分析揭示原代与永生化WJ-MSC来源EVs具有相似的miRNA和蛋白质货物谱
对小RNA测序数据的深入分析发现，两者EVs中RNA的种类组成和绝对读长计数相当。在表达最丰富的miRNA（top 20%）中，有65个是两者共有的。虽然存在少数差异表达的miRNA，但整体miRNA表达谱显示出高度的相关性（Spearman相关系数0.82）。蛋白质组学分析同样显示，两者EVs的蛋白质组成高度相似，主成分分析(PCA)中样本紧密聚类。差异表达蛋白分析仅鉴定出极少数有显著变化的蛋白，其中热休克蛋白90(HSP90)在原代EVs中略高，而hTERT蛋白本身在两组EVs中均未检测到。这证明永生化并未导致EVs货物内容的全局性重塑。
3.5. 原代与永生化WJ-MSC来源EVs在体外表现出相似的生物学活性
功能实验是检验EVs“疗效”是否改变的金标准。在抗炎实验中，两者EVs均能同等程度地抑制脂多糖(LPS)刺激的巨噬细胞产生一氧化氮(NO)。在抗纤维化实验中，两者EVs都能相似地降低转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的皮肤成纤维细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达。在促伤口愈合实验中，两者EVs处理均能显著加速内皮细胞划痕的闭合，且效果无显著差异。这些结果强有力地证明，来源于永生化MSCs的EVs保留了与原代EVs相当的抗炎、抗纤维化和促修复生物学功能。
3.6. hTERT的过表达既未增加EVs中的hTERT成分，也未诱导MSCs的锚定非依赖性增殖
安全性是永生化技术应用的底线。研究通过qPCR检测发现，永生化细胞及其EVs中可检测到微量的hTERT质粒DNA，但与原代相比并无显著富集。小RNA测序数据中映射到hTERT转录本的读段极少，且两组间无差异。更重要的是，软琼脂克隆形成实验显示，永生化MSCs与原代MSCs一样，几乎不形成克隆，而阳性对照HEK293细胞则大量形成，这表明hTERT永生化并未赋予这些MSCs锚定非依赖性生长的肿瘤细胞特性。
研究结论与意义
本研究系统性地证实，通过hTERT实现MSCs的永生化（端粒酶化），是一种极具前景的解决方案。它成功地破解了MSC-EVs规模化生产中的核心矛盾：一方面，永生化细胞获得了近乎无限的扩增能力，解决了细胞来源短缺和批次间差异大的问题，为建立稳定的“主细胞库”和生产细胞库奠定了基础，满足了标准化、大规模生产EVs的源头需求；另一方面，更重要的是，这种永生化过程是“温和”且“保守”的——它既没有改变MSCs作为“生产者”的核心身份（表面标志物、分化潜能）和正常生长特性（接触抑制、非致瘤性），也没有改变其“产品”EVs的关键质量属性（大小、标志物、主要货物组成）和核心功能（抗炎、抗纤维化、促愈合）。
该研究的发现具有重要的转化医学价值。它首次为利用单一供体来源的、经hTERT永生化的MSCs作为“细胞工厂”，来生产具有一致性和可重复性的治疗性EVs提供了坚实的实验依据。这种方法有望克服当前基于原代MSCs的EV疗法在产业化道路上面临的供体异质性、生产规模有限和产品质量波动等主要障碍，为推进EVs成为真正可临床应用的“现成”(off-the-shelf)生物制剂铺平了道路。未来，结合大规模三维生物反应器培养等技术，这种策略有望实现治疗级MSC-EVs的高效、经济、标准化生产，加速其从实验室向临床的转化进程。
