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在生物制药生产中，为保护细胞免受搅拌罐生物反应器中剪切力损伤而添加的表面活性剂对确保产品产量和质量至关重要。然而，商业表面活性剂存在批次间差异，可能导致生产失败。针对这一问题，研究团队开发了名为Peptonics的多肽表面活性剂家族。本研究将该家族中的ih-T1010扩展应用于生产单克隆抗体(mAbs)和腺相关病毒(AAV)的CHO与HEK293细胞。结果表明，ih-T1010在支持细胞生长、维持产品产量和质量方面与标准品Poloxamer F68相当，同时还能完全消除泡沫形成，实现无需额外添加消泡剂的生物反应器操作。这项研究为生物制造过程提供了一种更一致、更可控且能简化工艺的剪切保护剂新选择。
想象一下，在巨大的生物反应器中，无数哺乳动物细胞正在辛勤“工作”，为我们生产治疗癌症的单克隆抗体，或是用于基因治疗的病毒载体。然而，这些细胞非常娇贵，反应器内因搅拌和通气产生的微小剪切力，就足以对它们造成伤害，影响产量甚至导致生产失败。几十年来，工业界普遍在培养基中添加一种名为Pluronic（学名Poloxamer）的非离子表面活性剂，像“保护罩”一样包裹细胞，抵御剪切应力。但问题也随之而来：这种由化学聚合方法生产的聚合物，其分子链长度并不完全一致，存在固有的“多分散性”，导致不同生产批次间的性能存在差异。这种不可预测的“批次间差异”曾多次引发实际生产中的产品品质波动乃至整批报废，给制药公司带来巨大的财务和运营损失。此外，Pluronic还会在反应器中产生大量泡沫，迫使生产者必须额外添加化学消泡剂，而这又可能抑制细胞生长、污染下游纯化膜材，增加工艺复杂性。那么，是否存在一种既能稳定保护细胞、性能高度一致，又能从根本上避免泡沫问题的理想替代品呢？
由Ka Zhang、Eduardo Barbieri、Arianna Minzoni、Brandon Brino、Shriarjun Shastry、Morgan Hurst、M. Cyndell Gracieux-Singleton、Shahid Rameez、Sigma Mostafa和Stefano Menegatti组成的研究团队，在《Journal of Biotechnology》上发表的研究，给出了一种名为“Peptonics”的创新解决方案。这是一种受Pluronic启发而设计的多肽（及类多肽）表面活性剂家族。与化学聚合的Pluronic不同，Peptonics采用固相多肽合成技术生产，其分子序列和长度可被精确定义与控制，从而得到结构单一、性能一致的产物，从根本上消除了批次差异。在本研究中，团队重点评估了其中一种名为ih-T1010的类多肽（peptoid）表面活性剂。ih-T1010的分子骨架被改造为N-取代甘氨酸结构，以抵抗培养环境中蛋白酶的降解，其分子量精确为4.53 kDa，由聚丝氨酸（20个）-聚缬氨酸（10个）-聚丝氨酸（20个）的嵌段共聚物构成。
研究人员采用了多种关键技术方法系统评估了ih-T1010的性能。核心实验平台是搅拌罐生物反应器培养，包括3 L规模的玻璃台式生物反应器用于CHO细胞培养，以及Ambr250模块化高通量生物反应器系统用于HEK293细胞的AAV生产。研究使用了多种商业化细胞系，包括表达不同工程化单克隆抗体(mAb)的CHO-K1细胞、美国国家标准与技术研究院(NIST)的CHO-K1标准细胞系，以及用于瞬时表达腺相关病毒9型(AAV9)的HEK293F细胞。培养基方面，测试了三种不同的商业化CHO培养基和两种HEK293培养基。细胞生长、活率和关键代谢物（葡萄糖、乳酸、氨等）通过自动化细胞计数仪和生化分析仪进行监测。产物分析方面，单克隆抗体(mAb)的浓度通过蛋白G亲和色谱(ProG-HPLC)定量，聚合体和片段通过尺寸排阻色谱(SEC-HPLC)分析；AAV9的病毒颗粒滴度通过血清型特异性ELISA试剂盒测定，其包裹的基因组滴度通过微滴式数字PCR(ddPCR)定量，病毒转导活性则通过流式细胞术检测报告基因表达来评估。为了评估表面活性剂对下游纯化的影响，研究使用了Protein A亲和层析树脂(MabSelect SuRe? LX)纯化mAb，以及AAV特异性亲和树脂(AvXcel)纯化AAV9，并测定了其动态结合容量和纯化回收率。最后，利用液相色谱-电喷雾电离-质谱联用技术(LC-ESI-MS)对纯化后的产物进行完整质量分析，以检测是否存在Peptonic ih-T1010的残留。
3.1. 不同商业化细胞培养基中剪切保护性Peptonic ih-T1010的性能表现
研究首先在三种不同商业化CHO培养基（A、B、C）中，于3 L生物反应器内进行补料分批培养，比较ih-T1010、Pluronic F68（阳性对照）和不添加表面活性剂（阴性对照）的效果。在CHO培养基A和B中，添加ih-T1010的培养物达到了与Pluronic F68相当的峰值活细胞密度（VCC，最高约4.5×107cells·mL-1）和细胞活率（>82%），并获得了可比拟的单克隆抗体(mAb)终滴度（5.0-5.6 g·L-1）。而在无表面活性剂的对照中，细胞生长和产量均显著降低。在CHO培养基C中，Pluronic F68组在峰值VCC和最终mAb滴度（7.89 g·L-1）上略高于ih-T1010组（约6.9 g·L-1），但ih-T1010仍显著优于阴性对照。代谢物谱分析显示，使用ih-T1010和Pluronic F68的培养物代谢特征相似，而无表面活性剂的对照组则表现出更高的渗透压，提示细胞状态受损。
3.2. Peptonic表面活性剂ih-T1010在表达NIST mAb的CHO-K1细胞上的评估
为了验证ih-T1010在不同细胞系中的普适性，研究在表达NIST标准mAb的CHO-K1细胞上进行了测试。结果表明，在专有的基础培养基中，ih-T1010支持的细胞生长（峰值VCC约2.0×107cells·mL-1）和mAb产量（约1.0 g·L-1）与Pluronic F68及无表面活性剂对照相当，证明了其在不同宿主细胞中维持生产力的能力。
3.3. 使用Peptonic配制培养基生产的产品的质量属性
研究人员进一步分析了产物的关键质量属性。尺寸排阻色谱(SEC)显示，使用ih-T1010和Pluronic F68的培养上清中，单克隆抗体(mAb)的单体纯度、高分子量(HMW)和低分子量(LMW)杂质水平相当，且都在可接受范围内。下游纯化实验表明，使用Protein A亲和树脂纯化来自不同表面活性剂组的培养上清，其动态结合容量、产物回收率（均>93%）以及纯化后mAb的聚合体水平和宿主细胞蛋白(HCP)残留量均无显著差异。这证明ih-T1010与下游Protein A捕获步骤兼容，且不会引入额外的纯化负担。
3.4. Peptonic ih-T1010在HEK293细胞生产基因治疗病毒载体培养中的评估
研究将评估扩展至用于AAV生产的HEK293细胞。在两种商业化HEK293培养基中，与无表面活性剂对照（细胞活率迅速下降）相比，添加ih-T1010或Pluronic F68均能维持高细胞活率（>90%）。在一种培养基(HEK293 Medium A)中，ih-T1010组产生的AAV9病毒颗粒滴度（~8×1011vp·mL-1）与Pluronic F68组（1.59×1012vp·mL-1）处于同一数量级，且病毒转导活性（衡量功能活性的指标）相当甚至略优。在另一种培养基(HEK293 Medium B)中，虽然总滴度较低，但ih-T1010组产生了更高比例的全病毒颗粒。使用AvXcel亲和树脂纯化AAV9的结果显示，来自ih-T1010和Pluronic F68组的收获液具有可比拟的动态结合容量、高回收率（>94%）和显著的HCP去除效果。更重要的是，LC-MS完整质量分析证实，经过亲和层析纯化后，最终的单克隆抗体(mAb)和AAV9产品中均未检测到ih-T1010的残留，消除了对表面活性剂残留的担忧。
3.5. Peptonics减少细胞培养过程中的培养基发泡
本研究的另一个突出发现是ih-T1010卓越的防泡性能。在所有测试的CHO和HEK293细胞培养中，使用添加了ih-T1010的培养基，在整个培养期间（长达14天）生物反应器内都观察不到明显的泡沫形成。相比之下，使用Pluronic F68或不加表面活性剂的对照组均产生了大量泡沫，必须多次添加化学消泡剂才能防止“泡沫溢出”事故。这种固有的抑泡能力使得采用Peptonics的工艺可以完全避免使用消泡剂，从而规避了因添加消泡剂可能带来的细胞毒性、膜污染和下游纯化复杂化等一系列问题。
讨论与结论
本研究系统证实了Peptonic ih-T1010作为一种新型剪切保护剂，在生物制药制造中的卓越性能和多重优势。其核心价值体现在三个方面：性能等效性、过程简化和质量一致性。
在性能上，ih-T1010在支持多种CHO和HEK293细胞的高密度生长、维持高细胞活率、以及保障单克隆抗体(mAb)和AAV的产量与关键质量属性（如聚合体水平、糖基化模式、HCP清除）方面，与金标准Poloxamer F68表现相当。这证明了其作为“即插即用”替代品的直接可行性。
在过程上，ih-T1010带来了革命性的简化。其固有的、强大的抑泡能力，使得在搅拌罐生物反应器操作中完全无需添加外源性消泡剂成为可能。这不仅消除了因泡沫导致的运行风险（如过滤器堵塞、污染），也避免了消泡剂本身对细胞、下游过滤及层析步骤的潜在负面影响，显著降低了工艺复杂性。
在质量上，基于固相合成技术的Peptonics具有天然优势。与存在批次间差异的聚合Poloxamer不同，ih-T1010是序列明确、分子量单一的“单分散”分子，确保了从源头开始的、无与伦比的批次间一致性。这为生物制造工艺提供了前所未有的可预测性和稳健性，符合当前药品生产质量源于设计(QbD)和严格监管的趋势。
综上所述，Peptonics代表了一类颠覆性的细胞培养添加剂。它们不仅解决了传统表面活性剂批次差异的痛点，还额外赋予了“无泡化操作”这一巨大工艺优势。这项研究为生物制药行业，特别是对工艺稳健性和产品一致性要求极高的单克隆抗体和先进基因治疗药物（如AAV）的生产，提供了一种更可靠、更简单、更具前景的技术解决方案，有望成为未来生物制造平台的新标准。
