通过优化培养基和采用连续搅拌式生物反应器培养技术，增强了Damnacanthus major细胞中的蒽醌生物合成能力

聚羟基烷酸酯（PHAs）P(3HB-co-20mol%3HHx)和P(3HB)通过细菌发酵制备，并与聚己内酯（PCL）对比，评估其在神经组织工程中的应用。结果显示P(3HB-co-20mol%3HHx)薄膜具有更优的力学性能和细胞支持能力，包括神经元粘附、增殖、存活及分化效果优于PCL，而P(3HB)则逊色于前者。

　　

作者列表：Lara Santolin、Caroline S. Taylor、Bj?rn Weiske、David A. Gregory、Emmanuel Asare、Annabelle Fricker、Andrea Mele、John W. Haycock、Sebastian L. Riedel、Ipsita Roy

所属机构：英国谢菲尔德大学工程学院化学、材料与生物工程系，地址：Sheffield, South Yorkshire, S3 7HQ

摘要

聚羟基烷酸酯（PHAs）在神经组织工程领域展现出巨大潜力。聚(3-羟基丁酸-3-羟基己酸) [P(3HB-3HHx)] 具有优异的生物相容性、可生物降解性以及可调的机械性能，其柔韧性远优于纯聚(3-羟基丁酸) (P(3HB))。本研究探讨了通过工程改造的 Cupriavidus necator 菌株生产的 P(3HB-20mol%3HHx) 在神经组织工程中的应用潜力，并将其与由 Bacillus subtilis OK2 菌株生产的 P(3HB) 以及聚己内酯 (PCL) 进行了比较。这些聚合物通过分批或连续发酵法制备，随后制成溶剂浇铸薄膜，并对其形态、表面结构及机械性能进行了评估。同时，还研究了它们对 NG108-15 神经细胞增殖、存活和分化的支持能力。实验结果表明，P(3HB-20mol%3HHx) 薄膜更适合用于软组织工程；此外，P(3HB-20mol%3HHx) 在促进神经细胞粘附、增殖和存活方面表现优于 PCL（目前 FDA 批准用于周围神经修复的生物聚合物）。

章节摘要

引言

周围神经损伤（通常由交通事故等创伤引起）可能导致严重的感觉和运动功能障碍以及神经性疼痛（Pfister 等，2011）。对于长度超过 10 毫米的神经缺损，直接端对端缝合是不可行的，此时自体神经移植仍是临床上的金标准（Bell 和 Haycock，2012）。然而，这种方法受到供体部位并发症和组织供应不足的限制，因此亟需开发替代生物材料。

P(3HB-20mol%3HHx) 的生产、提取与纯化

P(3HB-20mol%3HHx) 是利用工程改造的 Cupriavidus necator 菌株 Re2058/pCB113（源自野生型 H16）生产的。该菌株缺乏天然的 PHA 合成酶基因 (phaC)，属于脯氨酸缺陷型（?proC）。pCB113 质粒中包含来自 Rhodococcus aetherivorans 的异源 PHA 合成酶和来自 Pseudomonas aeruginosa 的烯酰-CoA 水合酶 (PhaJ)，从而实现了基于脂肪酸的 P(3HB-20mol%3HHx) 的合成。

P(3HB-20mol%3HHx) 和 P(3HB) 的生产过程

共聚物 P(3HB-20mol%3HHx 在 150 升生物反应器中通过含有不同浓度游离脂肪酸 (FFA，2% 或 52%）的 WAF 培养基进行生产（图 1）。培养初期加入 10 毫克/升菜籽油以形成稳定的乳液，便于微生物接触后续添加的 WAF（WAF 在标准条件下熔点高且溶解度低）。两种培养过程中均出现了泡沫现象。

讨论

本研究通过细菌发酵制备了两种聚羟基烷酸酯 P(3HB-20mol%3HHx) 和 P(3HB)，并将其制成溶剂浇铸薄膜以进行物理和体外测试。核磁共振 (NMR)、傅里叶变换红外光谱 (FTIR) 以及凝胶渗透色谱 (GPC) 验证了这两种聚合物的生成及其结构。扫描电子显微镜观察发现，P(3HB-20mol%3HHx) 薄膜表面形成了孔隙和微米级晶体。

结论

总体而言，P(3HB) 和 P(3HB-20mol%3HHx) 在神经细胞粘附、增殖、存活及分化支持方面均优于 FDA 批准的聚己内酯 (PCL)。其中，通过工程改造的 Cupriavidus necator 菌株生产的 P(3HB-20mol%3HHx) 是一种有前景的神经组织工程材料，其良好的表面粗糙度有助于蛋白质的吸附。

未引用的参考文献

Bartels 等人（2020）；Noda 等人（2005）

CRediT 作者贡献声明

Sebastian Riedel：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、项目监督、资金筹集、概念构思。 Annabelle Fricker：实验研究、数据分析。 Emmanuel Asare：实验研究、数据分析。 John Haycock：实验研究、数据分析。 Andrea Mele：实验研究、数据分析。 Caroline Taylor：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、实验研究、数据分析。

利益冲突声明

作者声明可能存在以下潜在的利益冲突：I. Roy 教授（首席科学官）、D. A. Gregory 博士（技术顾问）和 Andrea Mele 博士（首席执行官）均为 PHAsT Limited 的董事。该公司致力于开发用于多种应用的生物医学级聚羟基烷酸酯 (PHAs)。

致谢

感谢所有参与该项目的合作伙伴。特别感谢 Nicola Green 在共聚焦显微镜实验中的协助，以及 Alice Pyne 在原子力显微镜 (AFM) 方面的支持。感谢德国 ANiMOX GmbH 的 Thomas Grimm 提供 WAF 培养基。同时，感谢已故的 Anthony Sinskey 教授（麻省理工学院）提供的工程改造 Cupriavidus necator 菌株。此外，还感谢英国工程与物理科学研究委员会 (EPSRC) 的资助（项目编号 EP/X026108/1、EP/V012126/1 和 EP/X024040/1），以及德国联邦政府的支持。