通过分子间氢键可控聚集实现BODIPY近红外光治疗性能增强的策略研究

《Smart Molecules》：Intermolecular hydrogen-bonded associates of BODIPYs drive controllable aggregates and enhanced NIR phototherapeutic performance

本研究通过合理设计并合成了一系列间位三氟甲基（meso-CF3）取代的BODIPY（氟硼二吡咯）染料，利用其分子间氢键（C-H?F）作用，实现了可控的J聚集体的构建。该策略成功诱导了显著的红移吸收（延伸至近红外NIR-II区），并赋予纳米颗粒优异的光热转换效率（PCE=49.7%）、大斯托克斯位移和产生I型活性氧（ROS）的能力，最终在体外对卵巢癌细胞展现了高效的光动力/光热协同治疗性能，为开发高性能有机光治疗剂提供了新思路。

　　

1 引言

长波长染料在生物诊断与治疗中具有组织穿透深、空间分辨率高、自发荧光背景低、信噪比高等优势。为实现光谱红移，常见的策略包括扩展共轭体系、构建推-拉电子（D-A）系统、引入杂原子以及形成J聚集体或分子间氢键缔合物（IHBAs）。其中，以氢键为代表的非共价相互作用因其独特的强度、方向性和选择性，成为构建复杂功能体系的基石。然而，在复杂环境（如自组装纳米材料）中精确预测和控制特定分子体系的缔合行为仍然是一大挑战。本研究聚焦于通过氢键自发、高度定向自组装形成的IHBAs。在D-A-D结构中，倾向于形成滑动堆叠的堆积模式，这种特定排列可导致常规J聚集、电荷转移耦合J聚集或氢键分子间缔合。然而，J聚集体的窄吸收峰常导致其与激光波长的匹配不佳，给光疗中激光的选择带来困难。本研究旨在通过分子间氢键耦合在J聚集体中产生光谱拓宽，这不仅能改善与激光波长的匹配，还为多色光吸收提供了关键途径。控制分子的堆叠方向和角度是一项关键且具有挑战性的任务。因此，本工作进一步系统研究了BODIPY氢键分子间缔合物的形成机制、结构特征和功能特性，通过结合光谱分析、晶体结构测定和理论计算模拟，旨在阐明模型分子系统中氢键缔合的驱动力和原理，不仅深化对氢键这一基本分子间作用力的理解，还为开发基于氢键的新型智能材料（如自组装纳米颗粒）提供坚实的理论基础和设计原则。此外，还证明了BODIPY的IHBAs适用于近红外区的卵巢癌细胞光动力-光热治疗。

2 结果与讨论

本研究采用两步合成策略制备了目标染料BODIPY（OBB, OHB, SBB, SHB）。首先，以2,4-二甲基吡咯为起始原料，制备了在meso位带有三氟甲基（-CF₃）旋转基团的前体，随后选择呋喃甲醛衍生物作为缩合剂，通过Knoevenagel缩合获得了具有D-A-D体系的BODIPY。所有染料的化学结构均通过核磁共振波谱和高分辨质谱进行了表征，呋喃/噻吩取代的BODIPY结构通过X射线分析得到了明确证实。从单晶的侧视图可以看出，OBB的BF₂基团显著偏离BODIPY母核，与其他三种染料相比发生了极其严重的扭曲。

2Cl₂中的吸收光谱以及 OBB NPs, OHB NPs, SBB NPs 和 SHB NPs 在水中的吸收光谱。(g–j) OBB, OHB, SBB 和 SHB 在 CH₂Cl₂中的发射光谱以及其纳米颗粒在水中的发射光谱。(k–n) OBB, OHB, SBB 和 SHB 在不同比例 THF-H₂O 混合溶剂中聚集效应导致的吸收光谱变化。">

首先，我们深入了解了它们的光谱性能。在有机溶剂二氯甲烷（CH₂Cl₂）中，四种染料单分子的最大吸收位于726–740 nm的近红外一区（NIR-I）范围，其中OBB吸收值最大，SHB最小。接着，我们检测了自组装纳米颗粒（NPs）和薄膜状态的吸收光谱以研究其聚集行为。DSPE-PEG₂₀₀₀和BODIPY自组装成胶束纳米颗粒。动态光散射分析表明，所得OBB NPs的流体动力学直径在60–200 nm范围内，平均尺寸约为109.6 nm，多分散指数（PDI）为0.23。透射电子显微镜进一步证实了其明确的纳米结构形态。此外，zeta电位测量显示OBB NPs的表面电荷为-32.7 mV，该值通常与良好的胶体稳定性相关。OBB NPs在水中的最大吸收波长位于880 nm，与其在二氯甲烷中的最大吸收波长（740 nm）相比发生了140 nm的红移。同样，OHB NPs和SBB NPs分别表现出74 nm和86 nm的红移。相比之下，SHB NPs仅显示出10 nm的微小红移。在薄膜状态的吸收光谱中也观察到了类似的红移；例如，OBB的最大吸收出现在937 nm。基于染料OBB单体和二聚体的理论吸收光谱，我们发现二聚体表现出新的特征峰形，这表明由分子间氢键相互作用引起的聚集导致了光谱红移。

6支持电解质的二氯甲烷中的循环伏安图。(b) 使用DCFH (10 μM) 或 (c) DHR123 (10 μM) 作为指示剂，监测 OB-BDP, OH-BDP, SB-BDP 和 SH-BDP (5 μM) 在808 nm激光 (0.3 W/cm²) 连续照射10分钟下的活性氧（ROS）生成。(d) 自组装OBB NPs的动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）图像，比例尺：100 nm。(e) 40 μM OBB NPs的Zeta电位。(f) OB-BDP, OH-BDP, SB-BDP 和 SH-BDP NPs (40 μM) 在0.4 W cm^?2光照射下的温差性能。(g) OBB NPs (40 μM) 在不同功率密度 (0.1–0.4 W cm^?2) 的808 nm激光照射下的光热转换。(h) 不同浓度 (10–40 μM) 的OBB NPs在808 nm激光照射 (0.4 W/cm²) 下的温度变化。(i) OBB NPs水溶液在照射和自然冷却下的温度响应曲线，以及 –Lnθ 与时间的线性拟合。">

在成功获得其单晶结构后，我们全面了解了它们在晶态下的聚集形态，这使我们能够对观察到的光谱红移提出合理的解释。在OBB的晶体堆积中，我们识别了相邻分子间的三种强氢键，键距分别为2.336 ? (C–H?F(BF₂))、2.470 ? (C–H?F(CF₃)) 和 2.488 ? (C–H?F(CF₃))。这些相互作用表明形成了IHBAs，从而导致了红移行为。对于OHB，晶体堆积的俯视图分析显示，每三个分子组装成一个采用J聚集构型的单元。存在2.489 ?的短C–H?F(BF₂)接触距离，表明存在强分子间氢键，这在强制这种有序堆积模式和调节相邻分子间的电子相互作用中起着关键作用。这种堆积排列与实验中观察到的展宽和红移的吸收特征有很好的相关性。类似地，SBB也表现出J聚集行为，尽管氢键距离稍长 (C–H?F(BF₂): 2.542 ?)。相比之下，SHB的晶体堆积没有显示出显著的分子间相互作用，这与单分子行为一致。总体而言，这些结构观察证实了D–A–D策略有效促进了多样的分子聚集模式并调节了分子间相互作用。

接下来，我们表征了它们的荧光光谱。虽然四种染料在有机溶剂中表现出相对较窄的发射范围（λ_em= 779–797 nm），但其纳米颗粒形式的发射最大值分布在一个更宽的范围内（λ_em= 890–967 nm）。由于聚集导致猝灭（ACQ），J聚集体的荧光量子产率低于单体。值得注意的是，溴代的OBB NPs在水中显示出87 nm的斯托克斯位移，明显大于在有机溶剂中观察到的50 nm。我们还发现，非溴代的OHB NPs在水溶液中表现出更大的斯托克斯位移，为124 nm。值得注意的是，SHB NPs在水中的斯托克斯位移达到了208 nm。

为了进一步了解OBB、OHB、SBB和SHB的聚集行为，我们在THF–H₂O混合溶剂中研究了它们的吸收特性。在纯THF中，OBB在约738 nm处显示出一个尖锐的吸收带。随着水分数（f_w）的增加，吸光度逐渐降低并发生红移，在f_w= 90%时达到890 nm。类似地，其他三种染料在f_w= 85%时在860–880 nm范围内表现出最大吸收。这些光谱位移归因于聚集结构内分子运动受限和分子间相互作用增强。

为了揭示OBB、OHB、SBB和SHB的光学性质，我们基于密度泛函理论（DFT）和含时密度泛函理论方法进行了理论模拟。这四种分子的主要吸收和发射峰都对应于S₀-S₁跃迁，该跃迁由最高占据分子轨道（HOMO）和最低未占分子轨道（LUMO）之间的跃迁组成。OBB、OHB、SBB和SHB单分子在二氯甲烷（DCM）中的实验和理论最大吸收波长λ_DCM显示出良好的一致性。同时，所有染料都具有高的摩尔消光系数，这为有效吸收光子提供了基础。值得注意的是，OBB、OHB、SBB和SHB NPs的实验最大吸收（λ_NP）与其单体在无溶剂条件下的理论最大吸收（λ_NAN）相比，表现出显著的红移（分别为220、169、160和97 nm）。这些显著的红移表明，分子聚集（通过分子间氢键相互作用）极大地改变了这些体系中的电子跃迁，这可能是由于增强的分子间电荷离域所致。

此外，我们使用循环伏安法研究了OBB的电化学行为。测量结果显示，在-0.622 V处有一个可逆的还原电位，在1.064 V处有一个氧化电位。根据关系式ΔE_HL≈ ΔE × e，OBB的HOMO-LUMO能隙接近于氧化还原电位差（1.686 V），支持了分子轨道计算的有效性。两个氧化还原过程都具有电化学可逆性。

接下来，我们使用2',7'-二氯二氢荧光素（DCFH）探索了四种染料的总体活性氧（ROS）生成能力。基于DCFH的荧光变化，在光诱导下可以产生一定量的ROS。为了进一步识别ROS的类型，我们基于1,3-二苯基异苯并呋喃（DPBF）作为单线态氧指示剂的吸光度衰减，研究了BODIPY产生单线态氧（¹O₂）的效率。如图所示，对于OHB和SHB，DPBF在416 nm处的吸光度仅随照射时间增加而略有下降，几乎不产生单线态氧。接着，使用二氢罗丹明123（DHR123）评估了I型ROS的生成。如图所示，所有四种染料在6分钟的照射期间都诱导了DHR123荧光强度的变化，表明其能有效产生I型ROS。这归因于扭曲诱导的系间窜越（ISC）。

接下来，我们通过监测在不同激光功率密度和纳米颗粒浓度下，温度随照射时间的变化，评估了四种纳米颗粒OBB NPs、OHB NPs、SBB NPs和SHB NPs的光热性能。在评估的四种NPs中，OBB NPs在所有测试条件下都表现出最稳健的光热性能，包括在不同功率密度下的温升、循环稳定性以及浓度依赖性效应。如图所示，OBB NPs溶液的温度在5分钟的照射期内与增加的激光功率密度（范围从0.1到0.4 W cm^?2）呈正相关。在0.1 W·cm^?2照射下，仅观察到适度的温升。相比之下，在0.4 W cm^?2照射下，温度显著升高，达到约35.1°C。这些结果表明，更高的功率密度显著增强了OBB NPs的光热转换效率（PCE）。如图所示，我们研究了OBB NPs浓度（10–40 μmol/L）对光热响应的影响。较高的浓度导致更显著的温升，40 μmol/L溶液在5分钟内达到的温度明显高于10 μmol/L溶液。然而，对于实际的生物医学应用，可能需要确定一个最佳的浓度范围。OBB NPs在周期性激光照射下的循环光热性能显示，温度在激光开启阶段迅速上升，在关闭阶段恢复到基线，在连续五个循环中表现出高可逆性。这种可重现的热响应证实了OBB NPs出色的光热稳定性，这是光热治疗中重复使用的关键特性。我们量化了所有四种NPs的PCE。根据从冷却时间和温度获得的相关时间常数，OBB NPs实现了最高的PCE值49.7%，而其他三种纳米颗粒的PCE值均低于48%。这些结果共同表明，与所研究的其他NPs相比，OBB NPs在激光照射下具有更优异的光热性能。同时，OBB NPs在不同缓冲体系（细胞培养基和PBS）中表现出良好的稳定性。因此，我们选择OBB NPs用于后续的生物学研究。

我们通过CCK8实验评估了OBB NPs在有或无激光照射下对人类卵巢癌细胞的潜在细胞毒性。如图所示，在没有激光辐射的情况下，OBB NPs对A2780和SK-OV-3细胞表现出显著的生物相容性，即使在100 μM浓度下，A2780和SK-OV-3细胞的存活率也高于60%。然而，在相同剂量范围内，经过5分钟光照射的OBB NPs显示出低得多的细胞活力，这表明OBB NPs具有低暗细胞毒性和高光毒性。OBB NPs对A2780和SK-OV-3细胞的抑制作用是浓度依赖性的，对A2780细胞的抑制率在50 μM浓度时达到50%，对SK-OV-3细胞在40 μM浓度时达到50%，我们选择这些条件作为后续实验的条件，以进一步研究OBB NPs的光治疗性能。

然后，我们使用钙黄绿素AM（绿色）和碘化丙啶（红色）染料进行活死细胞染色，以可视化激光照射下OBB NPs的细胞毒性。正如预期，在50 μM OBB NPs存在下，经过5分钟激光照射（0.3 W/cm²）后，在A2780细胞系中观察到显著的细胞死亡。相应地，在相同激光条件下暴露于40 μM OBB NPs的SK-OV-3细胞系也表现出死亡细胞比例显著增加。由于细胞膜完整性丧失导致的红色荧光增强证明了这些现象。相比之下，单独暴露于光或单独暴露于OBB NPs的细胞显示出占主导地位的绿色荧光，与对照组相似，表明对细胞活力的影响最小。结果表明，经激光照射的OBB NPs有潜力诱导人卵巢癌细胞死亡。

光疗诱导两种主要的细胞死亡形式：程序性凋亡和崩解性坏死。目前正在研究新型OBB NPs诱导细胞死亡的机制。因此，我们使用Annexin V-FITC/PI作为荧光标记，对A2780和SK-OV-3细胞进行流式细胞术分析，以区分OBB NPs引起的这些细胞凋亡阶段。Annexin V染色指示细胞凋亡的早期阶段，PI染色指示晚期凋亡或死亡细胞。我们注意到，OBB NPs + 光处理组对A2780细胞的凋亡百分比超过18.9 ± 0.9%，主要处于早期和晚期凋亡阶段。而用OBB NPs + 光处理的SK-OV-3细胞的凋亡率为22.4 ± 1.3%，这些死亡细胞大多处于晚期凋亡或坏死阶段。数据总体上表明OBB NPs能有效诱导卵巢癌细胞凋亡和坏死。

为了研究OBB NPs在卵巢癌细胞中诱导ROS的情况，我们测量了不同处理组中的细胞内ROS水平。如图所示，对照组表现出可忽略的ROS水平。单独用OBB NPs处理或单独用光照射处理的细胞（A2780和SK-OV-3）显示出非常低的ROS水平。相比之下，用OBB NPs加光照射处理的细胞产生了极高的ROS水平。这些发现表明，ROS介导的氧化应激是OBB NPs诱导光疗性细胞死亡的关键机制。

3 结论

基于本研究的综合发现，我们最终证明，在BODIPY染料中策略性地引入间位三氟甲基（meso-CF₃）基团和呋喃/噻吩杂环，能够通过分子间氢键（C-H?F）精确控制其分子堆积。这些具有临界距离（在2.336 ?至2.542 ?之间）的特异性非共价相互作用，引导了明确的纳米结构（如氢键缔合物）的形成。这种可控的聚集行为有助于实现理想的光物理性质，包括吸收显著红移到近红外二区（NIR-II）窗口以及吸收带拓宽，从而促进有效的光捕获和激光匹配。值得注意的是，优化的纳米颗粒制剂OBB NPs表现出作为光疗剂的优异性能，其特征包括高光热转换效率（49.7%）、大斯托克斯位移和强大的I型ROS生成能力。该系统的功效通过其对卵巢癌细胞的卓越光毒性得到强调，主要通过ROS介导的凋亡和坏死途径诱导细胞死亡，同时保持最小的暗毒性。这项工作成功地建立了基本的构效关系，强调了定向分子间氢键在调控有机纳米材料的聚集和功能中的关键作用。这里阐明的见解和设计原则为未来开发用于精准癌症治疗的高效聚集工程光治疗剂提供了一个稳健的平台。