Zejun Liu|Mengqi Yan|Meiting Jiang|Jingqun Liu|Changcheng Peng|Ruitong Du|Xiang Yuan|Weijie Yang|Lihong Wu|Deqiang Yang|Meng Wang|Chunjuan Yang|Haixue Kuang|Zhibin Wang
教育部北方药基础与应用研究重点实验室，黑龙江中医药大学，哈尔滨150040，中国
摘要
对天然产物成分进行系统表征对于产品开发和质量控制至关重要。Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge的根（AMR）和叶（AML）被用于食品和健康相关产品中。然而，AMR和AML中的三萜类化合物组成尚未完全明确。本研究提出了一种策略，将虚拟数据库与苷元相结合，以系统地鉴定AMR和AML中的三萜类化合物。通过整合先前报道的三萜类化合物，总结了三萜类化合物的苷元、取代基和糖基团，构建了一个虚拟数据库。随后，将原始数据与虚拟数据库进行比较，并通过检测MS/MS光谱中的苷元来消除假阳性结果，从而筛选潜在的三萜类化合物。共鉴定出421种潜在的三萜类化合物，其中158种来自AMR，283种来自AML。在这些化合物中，有319种被认为是潜在的新化合物。此外，还鉴定出6种可作为区分AMR和AML的化学标记物的三萜类化合物。本研究系统地表征了AMR和AML中的三萜类化合物，增进了我们对这两种材料中三萜类化合物的理解，并为AMR和AML的进一步开发奠定了基础。此外，本研究还开发了一种工作流程，利用数据独立采集模式深入挖掘未知化合物。
引言
准确鉴定和深入表征天然产物的代谢物对于发现新的先导化合物至关重要[1,2]。超高效液相色谱结合高分辨率质谱（UPLC-HRMS）由于其高分离度和灵敏度，为天然产物成分的系统表征和新型化合物的鉴定提供了一种有效方法[[3], [4], [5]]。然而，天然产物的化学组成复杂以及固有的基质干扰给化合物的准确鉴定和系统表征带来了挑战。由于上述困难，天然产物中的微量代谢物难以被完全表征，这限制了新型化合物的发现。
目前，数据依赖采集（DDA）模式已被广泛用于天然产物代谢物的表征[6,7]。天然产物中化学成分的鉴定依赖于将前体离子与已知化合物匹配并解释MS/MS光谱。为了加快潜在目标化合物的鉴定速度，人们采用了多种数据处理技术来分析天然产物的化学成分，如内部数据库[8]、诊断离子过滤（DIF）[[9], [10], [11]]和中性丢失过滤（NLF）[12,13]。尽管上述方法在天然产物成分的系统表征方面具有一定优势，但由于DDA模式依赖于前体离子强度来获取MS/MS光谱，一些微量成分仍难以完全鉴定。数据独立采集（DIA）模式通过采集样品中所有前体离子的MS/MS光谱来记录所有离子信息[[14], [15], [16]]。在DIA模式下，MS/MS光谱中的产物离子可能来自多个前体离子，这使得化合物的准确鉴定变得复杂。因此，必须使用去卷积等技术处理DIA模式下获得的原始数据，以正确关联前体离子与其相应的MS/MS光谱[17]。然而，DIA模式产生的大量原始数据使得手动注释变得复杂，并阻碍了未知化合物的鉴定。因此，开发一种能够快速筛选候选离子并消除假阳性的分析方法对于实现DIA模式下的高通量数据注释至关重要。
Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge（AM）长期以来既被用作药物也被用作食品。最近，由于其免疫调节、抗氧化和降血糖的生物活性，AM的根（AMR）越来越被认为是一种健康食品[[18], [19], [20], [21]]。AM的叶（AML）因其抗氧化特性和增强免疫的作用而受到关注，适合用于各种功能性食品，如茶叶[22]。从AM中有效分离出了多种植物化学物质，如皂苷、黄酮类、氨基酸、生物碱和有机酸[23]。三萜类化合物是AM中的主要活性成分，其中astragaloside Ⅳ是一种代表性化合物[24]。近年来，从AMR和AML中分离并鉴定了近100种三萜类化合物[25]。目前，AM中仍有许多未发现的三萜类化合物，它们具有显著的药理作用，包括新型化合物和已知化合物的异构体。此外，准确鉴定AMR和AML中的化学成分对于确保AM产品的质量控制至关重要。
本研究提出了一种分析策略，将虚拟数据库与苷元相结合，用于系统地表征AMR和AML中的三萜类化合物（图1）。这种方法使得在DIA模式下对化合物进行注释成为可能，解决了该模式下MS/MS光谱的复杂性问题，并促进了天然产物中化学成分的深入表征。该方法共鉴定了421种三萜类化合物，其中158种来自AMR，283种来自AML。其中，319种三萜类化合物被认为是潜在的新化合物。研究结果表明，这种分析方法能够一致地鉴定AMR和AML中的三萜类化合物，为未来的药理学研究和质量控制提供了可靠的基础。此外，该策略还将虚拟数据库与特征性苷元片段的分析相结合，实现了高选择性和广泛覆盖，从而便于将其扩展到其他天然产物类别的深入表征。
材料与试剂
Astragaloside Ⅰ、Astragaloside Ⅱ、Astragaloside Ⅳ、Brachyoside B和Cycloastragenol购自上海豫源生物技术有限公司（中国上海）。化合物Huangqiyenin A、F、M、O、Q、T、U、V和W之前已被分离和鉴定[26]。所有化合物的结构见图S1。所有化合物的纯度均超过98%。乙腈（LC-MS级）购自Thermo Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。去离子水使用Milli-Q装置制备。
三萜类化合物的全面注释
为了系统地表征AMR和AML中的三萜类化合物，本研究开发了一种分析策略，将虚拟数据库与以苷元为中心的分析相结合。该策略在Python中实现。基于已建立的内部数据库，首先总结了三萜类化合物的苷元、取代基和糖基类型。在此基础上，通过随机组合构建了AM中特征性三萜类化合物的虚拟数据库。随后，对原始数据进行了处理
结论
为了深入表征天然产物中的未知成分，本研究开发了一种分析策略，将虚拟数据库与特征性质谱片段相结合，用于系统地表征AMR和AML中的三萜类化合物。该方法首先总结了之前在AM中鉴定出的已知三萜类化合物的苷元、取代基和糖基团，从而构建了一个包含2,767个独特质量的虚拟三萜类化合物数据库
CRediT作者贡献声明
Zejun Liu：撰写——原始草稿，正式分析。Mengqi Yan：正式分析。Meiting Jiang：撰写——审阅与编辑。Jingqun Liu：资源获取。Changcheng Peng：实验研究。Ruitong Du：实验研究。Xiang Yuan：软件支持。Weijie Yang：软件支持。Lihong Wu：软件支持。Deqiang Yang：软件支持。Meng Wang：软件支持。Chunjuan Yang：软件支持。Haixue Kuang：实验研究。Zhibin Wang：资金获取、项目管理、撰写——审阅与编辑。
资助
本研究得到了黑龙江省重点研究计划（项目编号GA22B012）、国家自然科学基金科研项目（项目编号81973439）、黑龙江省中医药研究项目（项目编号ZHY2024-049）以及黑龙江省头雁创新团队计划（项目编号[2019] No.5）的支持。
CRediT作者贡献声明
Zejun Liu：撰写——原始草稿，正式分析。Mengqi Yan：正式分析。Meiting Jiang：撰写——审阅与编辑。Jingqun Liu：资源获取。Changcheng Peng：实验研究。Ruitong Du：实验研究。Xiang Yuan：软件支持。Weijie Yang：实验研究。Lihong Wu：软件支持。Deqiang Yang：软件支持。Meng Wang：软件支持。Chunjuan Yang：软件支持。Haixue Kuang：实验研究。Zhibin Wang：撰写——审阅与编辑，项目管理，资金获取。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文所述的工作。
