整合性脂质组学分析及可解释的机器学习方法，用于肉类和骨粉的物种特异性鉴定

《Journal of Chromatography A》：Integrative Lipidomics Profiles and Explainable Machine Learning for Species-Specific Identification of Meat and Bone Meal

基于非靶向脂质组学技术对76份肉骨粉样本进行系统性分析，鉴定出46个具有物种特异性的脂质生物标志物，并建立支持向量机模型实现100%分类准确率，SHAP分析揭示TG(44:0)、TG(49:0)、Cer(t41:1)为关键鉴别脂质。

　　

Bing Gao|Zhichao Yang|Jiabin Zheng|Haitao Yu|Xin Wang|Gangshan Wu|Hao Liang

中国江苏省句容市江苏农林职业学院信息工程学院，邮编212400

摘要

在许多地区，准确鉴定肉骨粉（MBM）的物种是监管要求，以防止动物饲料中的同种物质循环利用（即“同类相食”现象）。这种做法会通过受朊病毒污染的饲料促进牛海绵状脑病的传播。本研究首次全面应用非靶向脂质组学方法，系统地分析了来自四个物种的76个肉骨粉样本的脂质组成特征。共鉴定出4,180种脂质分子，并将其分类为43个脂质亚类。通过严格的评估标准（P<0.05，VIP>1.00，FC>1.50或FC<0.67），成功筛选出46种高度物种特异性的脂质生物标志物。利用这些具有区分性的脂质的丰度特征，我们使用多种机器学习算法建立了优化的物种鉴定模型。支持向量机模型表现出卓越的性能，分类准确率达到100%。后续的Shapley加性解释分析表明，TG(44:0)、TG(49:0)和Cer(t41:1)三种脂质分子对物种区分的贡献最大。该分析框架结合了脂质组学特征和可解释的机器学习方法，为肉骨粉的精确物种鉴定奠定了科学基础。

引言

肉骨粉（MBM）是一种具有高生物价值的动物源性蛋白质饲料成分，历史上在畜牧业中被广泛使用[18]。牛海绵状脑病（BSE）的爆发不仅造成了巨大的经济损失，还对公共卫生控制带来了重大挑战[19]。研究表明，同类相食的喂养方式是朊病毒（BSE的病原体）的主要传播途径，目前尚无有效的治疗干预措施[14]。为了减少BSE的传播，许多国家和地区已经实施了禁止在动物饲料中循环使用肉骨粉的法规[11]。

为了确保合规性，研究肉骨粉的物种间差异已成为一个关键的研究焦点。现有的官方检测方法包括光学显微镜（LM）和聚合酶链反应（PCR）。LM通过观察骨颗粒和肌肉纤维结构来进行物种鉴定，这依赖于操作人员的专业知识[13]。PCR可以检测特定物种的DNA片段，但其效果会因肉骨粉在高温高压处理过程中的DNA降解而受到影响[17]。

为了解决上述问题，研究人员对肉骨粉的物种间差异进行了多维度分析。在蛋白质组成方面，Han等人使用超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）技术分析了肉骨粉中组氨酸二肽的物种特异性差异[8]。他们的研究发现，肌肽/鹅肌肽比值能有效区分肉骨粉的来源：猪和牛的样本比值显著高于7.69，而鸡和羊的样本比值低于2.71。后续研究通过UHPLC-MS/MS鉴定出肉骨粉的物种特异性肽标志物，并开发了基于酶联免疫吸附测定的鉴定方法，同时评估了该方法对乳制品和明胶等法定添加剂的抗干扰能力[22,23]。在矿物质成分方面，Wang等人应用电感耦合等离子体质谱技术分析了骨颗粒的元素特征，发现Sr和Ba是反刍动物肉骨粉样本中的区分性元素。激光诱导击穿光谱数据用于构建物种区分模型，其准确率达到1.000，能够完美区分反刍动物和非反刍动物的肉骨粉[25]。在脂质组成分析中，Pu等人最初使用气相色谱技术分析了37种脂肪酸（FA）的模式，实现了超过0.890的物种区分准确率[20]。然而，脂肪酸仅代表部分脂质成分，且甲酯化会改变脂质的原始结构。后续的红外光谱和1064纳米拉曼光谱分析显示，通过指纹光谱特征能够实现更准确的物种区分，PLS-DA模型的准确率超过0.920[4,6,7,21]。

综上所述，这些发现强调了使用UHPLC-MS/MS进行肉骨粉全面脂质组学分析的必要性，以揭示具有物种区分性的脂质分子。非靶向脂质组学技术可以全面获取样本的脂质组成信息，并广泛应用于样本的差异挖掘[12,26,27]。本研究将推进基于脂质组学的肉骨粉物种鉴定方法的发展，并为利用脂质特征开发光谱学肉骨粉物种区分技术提供理论基础。

样本制备

肉骨粉样本的制备

肉骨粉（MBM）原材料（来自畜禽屠宰废弃物）是从中国北京的屠宰场和超市收集的。按照欧盟推荐的工艺流程，经过高温/高压灭菌、干燥、脱脂和粉碎等步骤制备了76个MBM样本[9]。新鲜的屠宰副产品经过清洗后切成小块，放入高压灭菌器中加热处理（20分钟，133°C）。

差异显著性分析

如图1A所示，在正离子和负离子模式下，从肉骨粉（MBM）样本中共鉴定出4,180种脂质分子，涵盖43个脂质亚类。根据脂质组学标准框架，所有4,180种脂质均通过LipidSearch软件被鉴定为第二级（假定性注释），需要满足准确的质量匹配（≤5 ppm的前体容忍度）和MS/MS光谱与计算机模拟的碎片库的匹配要求。

结论

本研究使用UHPLC-MS/MS技术系统地从四个物种的76个肉骨粉样本中获取了脂质组学信息，共鉴定出4,180种脂质分子。通过分析脂质丰度的差异（p<0.05），发现了1,252种具有物种间变异性的脂质分子。PLS-DA分析显示，基于VIP评分（VIP>1.00）的86种脂质分子对物种区分具有显著贡献。倍数变化分析（FC>1.50或FC<0.67，p<0.05）进一步证实了这些脂质的显著丰度差异。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

资金来源

本研究得到了江苏省农业科学院高层次人才科研启动计划（2024rc47）、浙江省自然科学基金（项目编号LQN25C160004）、浙江省博士后研究计划（项目编号ZJ2024132）以及浙江农林大学科学研究基金（项目编号2022LFR107）的支持。

作者贡献声明

Bing Gao：撰写——初稿、可视化、软件使用、资源准备、方法设计、实验设计、概念构思。 Zhichao Yang：撰写——审稿与编辑。 Jiabin Zheng：撰写——审稿与编辑。 Haitao Yu：撰写——审稿与编辑。 Xin Wang：撰写——审稿与编辑。 Gangshan Wu：撰写——审稿与编辑、资金筹集、概念构思。 Hao Liang：撰写——审稿与编辑。

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本文工作的财务利益冲突或个人关系。