超高性能液相色谱-质谱联用技术用于测定犬血清和皮肤组织中的阿奇霉素含量

《Journal of Chromatography B》：Ultrahigh performance liquid chromatography mass spectrometry for the determination of azithromycin in canine serum and skin tissue

【字体：大中小】 时间：2026年03月13日 来源：Journal of Chromatography B 2.8

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　　本研究开发了并验证了一种简便且重现性好的UHPLC–MS方法用于量化犬血清和皮肤组织匀浆中的阿奇霉素。该方法采用HSS C18色谱柱和正离子电喷雾模式，以氘代罗红霉素为内标，验证指标符合ICH M10标准。临床样本分析显示阿奇霉素在患病皮肤中浓度高达51.8μg/g，显著高于血清水平，证实其组织积累特性。该验证方法为兽医和转化医学研究提供了敏感且经济的药代动力学分析工具。

阿普尔瓦·帕蒂尔（Apurva Patil）| 迈克尔娜·奥斯特尔（Michaela Austel）| 迈克尔·G·巴特利特（Michael G. Bartlett）

美国乔治亚大学药学与生物医学科学系，雅典市，GA 30602

摘要

我们开发并验证了一种简单且可重复的UHPLC–MS方法，用于定量犬血清和皮肤组织匀浆中的阿奇霉素。该方法使用Waters Acquity UHPLC色谱仪和Quattro Micro三重四极杆质谱仪，在正电喷雾模式下进行检测。由于阿奇霉素在5至30 eV范围内的碎片化程度较低，因此采用前体离子([M + H]^+（m/z 749.25）在选离子记录（SIR）模式下进行定量；而罗红霉素([M + H]^+（m/z 838.6）作为内标。色谱分离使用HSS C18柱（2.1 × 100 mm，1.7 μm），样品处理前用乙腈沉淀蛋白质。该方法在0.02–1.2 μg/mL范围内呈线性（r^2 > 0.99），准确度和精密度均在±15%以内，两种基质中的回收率均超过85%。定量下限为0.02 μg/mL，符合ICH M10的验证标准。应用该方法对感染了Pythium insidiosum和Paralagenidium karlingii的犬临床样本进行分析，结果显示血清中的阿奇霉素平均浓度为0.702 μg/mL，组织匀浆并稀释后病变皮肤中的浓度为51.8 μg/g，这表明阿奇霉素在组织中积累了大量药物，与其药代动力学特性一致。这种经过验证的方法为兽医和转化药代动力学研究提供了一种灵敏且经济高效的方法。

引言

像Pythium insidiosum和Paralagenidium karlingii这样的卵菌是兽医和人类医学中新兴的病原体。尽管这些生物在形态上与真菌相似，但它们的细胞膜中缺乏麦角甾醇，并且对大多数常规抗真菌疗法具有天然抗性[1][2]。在犬类患者中，皮肤皮真菌病和副皮真菌病通常表现为进行性的结节性或溃疡性皮下病变，当无法进行手术切除时预后较差[3]。治疗选择有限，目前尚无标准化的药物治疗方案。

阿奇霉素（AZI）是一种半合成的唑烷类大环内酯类药物，由于其广谱抗菌性、良好的药代动力学特性和出色的组织渗透性而成为有吸引力的候选药物。阿奇霉素的结构是在红霉素的内酯环中插入一个甲基取代的氮原子，从而提高了其酸稳定性、增强了口服生物利用度，并延长了半衰期，使其可以实现每日一次给药[4][5]。重要的是，阿奇霉素会在组织及吞噬细胞中积累，在犬类患者的中耳积液和其他血管外部位的组织浓度比血浆浓度高几个数量级[6][7]，这使得它在需要高组织浓度的感染中特别有用。

多项证据支持阿奇霉素在管理卵菌感染中的潜在作用。在兔子实验中，单独使用阿奇霉素或与米诺环素联合使用可显著减轻皮肤皮真菌病的病变程度[8]。体外敏感性测试显示，阿奇霉素对Pythium insidiosum的抑制浓度（MIC）因菌株而异，范围为8至64 μg/mL，表明其疗效可能因菌株而异[9]。在犬类中，阿奇霉素已被用于治疗多种感染性疾病，并在相关实验和辅助治疗中进行了研究，但结果各不相同。然而，阿奇霉素在犬组织（尤其是病变皮肤）中的药代动力学行为仍不明确。鉴于阿奇霉素在细胞内的积累、从吞噬细胞中的缓慢释放以及其在组织中的持久存在，这一知识空白值得关注，因为这些特性有助于维持感染部位的持续药物暴露，而仅通过血浆浓度可能无法充分反映这一点[10]。

为了研究阿奇霉素的药代动力学和组织分布，可重复的分析方法至关重要。已有许多基于液相色谱（LC）的检测方法，尤其是针对血浆和血清的方法，大多数方法采用多反应监测（MRM）模式的LC–MS/MS技术，能达到低 ng/mL范围的定量限（LLOQ）。这些方法中的样品制备通常采用液-液萃取（LLE）或固相萃取（SPE），虽然可以减少基质效应，但会增加时间和成本[11][12][13]。少数人类血浆检测方法使用了蛋白质沉淀（PPT）技术，但这些方法通常与串联质谱（tandem MS）和稳定同位素标记的内标结合使用[11]。

由于组织样本的生物复杂性以及阿奇霉素在组织中的显著积累，其在组织中的定量更加具有挑战性。在犬类研究中，LC–MS/MS分析显示皮肤组织中的阿奇霉素浓度远高于血清[15]。其他针对人类和啮齿动物肺部、淋巴结和中耳黏膜的研究也采用了SPE或LLE结合MS/MS检测的方法[5][11]。尽管有这些研究，但经过验证的组织检测方法仍然有限，且尚未包括针对犬皮肤组织匀浆的蛋白质沉淀步骤。

本研究通过开发并验证了一种简化的UHPLC–MS（SIR）方法来定量犬血清和皮肤组织匀浆中的阿奇霉素，该方法符合ICH M10指南的要求，并应用于接受阿奇霉素治疗的非可切除性卵菌感染（Paralagenidium karlingii和Pythium insidiosum）犬患者的血清和病变皮肤样本。据我们所知，这是首个使用蛋白质沉淀技术进行犬病变皮肤阿奇霉素定量的LC/MS（SIR）方法，为兽医和转化药理学研究提供了便捷的工作流程。

方法部分

化学品和试剂

阿奇霉素参考标准品（纯度≥98%）购自Tocris Bioscience（英国布里斯托尔；CAS 83905–01-5）。内标罗红霉素（98%）购自J&K Scientific（美国新泽西州纽瓦克；CAS 80214–83-1）。LC–MS级乙腈（Optima LC/MS，Fisher Chemical，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）、水（Optima LC/MS，Fisher Chemical）和甲酸（Optima LC/MS，Fisher Chemical）用于所有组织匀浆、流动相制备和样品处理。

方法性能概述

经过验证的UHPLC–MS（SIR）方法能够可靠地定量犬血清和病变皮肤组织匀浆中的阿奇霉素。该方法在所有评估的验证参数下均表现出一致的分析性能，尤其是在使用蛋白质沉淀处理的生物样本中。

选择性和特异性

通过分析六批空白样品确认了该方法的选择性。

讨论

方法开发旨在实现阿奇霉素在血清和皮肤组织匀浆中的稳定色谱性能和可重复的电离效果。早期使用BEH C18和ACE C18（2.1 × 100 mm，1.7 μm）柱进行的色谱试验显示，阿奇霉素和内标的峰对称性不佳且保留时间不稳定，这可能是由于它们的疏水性选择特性所致。相比之下，HSS C18柱提供了最佳的性能，得到了清晰、对称的色谱峰。