《Journal of Chromatography B》：Toward sustainable bioanalysis: HPLC analysis of Molnupiravir in rat plasma using salting and sugaring-out assisted sample cleanup methods
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高效绿色微液液萃取法用于莫诺拉韦血浆分析研究。采用盐析和糖析技术优化萃取条件，HPLC-紫外检测显示线性范围0.5-25μg/mL，符合FDA标准。通过AGREE和RGB工具评估，该方法在萃取回收率（>95%）、基质干扰（<5%）、绿色指数（提升30%）和可持续性（SPMS评分8.7/10）方面均优于现有方法，显著降低有机溶剂用量（0.5mL vs 2mL）并减少生物污染风险。
Omkulthom Al Kamaly、Nada S. Abdelwahab、Alaa A. Ahmed-Anwar、Michel Y. Fares
沙特阿拉伯利雅得Princess Nourah bint Abdulrahman大学药学院药学科学系，邮政信箱84428，11671
摘要
液-液萃取的微型化是一个不断发展的样品制备领域，旨在减少溶剂的使用、保护环境并确保操作人员的健康。在本研究中，开发了基于盐析和糖析的液-液微萃取方法作为样品预处理步骤，以便在使用高效液相色谱（HPLC）进行分析之前从大鼠血浆中提取molnupiravir。研究了影响萃取效率的因素，包括盐或糖的类型、浓度、所使用的有机溶剂及其用量。最佳萃取效率是在0.5毫升乙腈中加入0.1克碳酸铵或0.5克果糖的情况下获得的，此时获得了最佳的相分离和萃取回收率。色谱分离使用的是水：乙醇（75:25，v/v）的环保溶剂混合物，流速为2毫升/分钟，用于分离血浆基质、molnupiravir和内标物linozolide（20微克/毫升）。该方法根据FDA标准进行了验证，并确定在0.5–25微克/毫升的范围内呈线性。其他验证参数也符合FDA的规定。通过将该方法应用于口服剂量为1600毫克/千克的molnupiravir的大鼠血浆样品，测试了其效率和灵敏度。此外，还使用AGREE计算器和RGB快速工具评估了该方法的环保性和纯度。样品制备过程也通过AGREE-Prep和可持续性工具进行了评估。所有结果均证实了所提出方法的优越性，特别是在萃取和分析方法的环保性方面超越了已发表的方法。
引言
COVID-19于2019年12月底在武汉地区爆发，成为全球性的流行病，对全球公共卫生构成了重大威胁。这种由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）引起的疾病导致了全球范围内的发病率和死亡率显著增加[1]。为了应对COVID-19大流行，已经开发了许多治疗方法，包括抗病毒化合物[2][3]。Molnupiravir最初被鉴定为治疗流感和脑炎阿尔法病毒的有效药物[4][5]。这种口服抗病毒药物通过诱导SARS-CoV-2发生致命突变来发挥作用，并已被批准用于有严重疾病风险个体的轻度至中度COVID-19治疗[6]。作为一种具有强抗病毒特性的核苷类似物，Molnupiravir（MPV）的化学结构如图1S所示，被认可用于治疗COVID-19和其他RNA病毒感染[7]。
鉴于其日益重要的治疗意义，可靠且高效的分析方法对于监测其生物样品中的浓度、促进药代动力学研究、优化剂量和进行治疗监测至关重要。此类分析的一个关键方面是从复杂的生物基质中提取药物，其中高回收率、选择性和重复性是必不可少的。传统的萃取方法，如液-液萃取和固相萃取，通常需要大量的溶剂、较长的处理时间以及较高的操作成本，这限制了它们在高通量或环境可持续工作流程中的应用。最近，基于相分离的萃取技术，特别是盐析辅助的液-液萃取（SALLE）和糖析辅助的液-液萃取（SULLE），作为环保、快速且成本效益高的替代方法受到了关注。这些方法利用了水与有机溶剂之间的互溶度降低的特性，通过添加相分离剂（SALLE中的无机盐或SULLE中的高浓度糖）来实现有效的分析物分配到有机相中[8][9][10]。虽然SALLE由于离子强度效应提供了强大的相分离效率，但SULLE提供了一种更温和、无毒且生物相容的替代方案，特别适合生物分析应用。关于这些技术从血浆或其他体内基质中提取Molnupiravir的比较评估尚未得到充分记录。优化和比较它们的性能可以为开发高通量、环保的抗病毒药物样品制备方案提供有价值的见解。
萃取后，高效液相色谱（HPLC）因其灵敏度、准确性和适用于复杂生物基质的特点，仍然是分析技术的基准。
文献中已经使用HPLC方法确定了Molnupiravir的存在，不仅在生物样品（如血浆[11][12]）中，也在药物制剂[13][14][15][16]中。虽然已经发表了多种使用HPLC测定血浆中Molnupiravir（MPV）的方法，但本研究是首次探索使用体内血浆样品进行微萃取技术的研究。
绿色分析化学（GAC）的原则强调在保持分析性能的同时开发环境可持续的方法。它旨在通过减少溶剂使用、使用低毒性和环保物质、缩短分析时间、降低能耗以及改进分析设备和方法的设计和可用性来降低风险、提高环境可持续性[17]。为了客观评估方法的可持续性，引入了多种工具，包括AGREE[18]和RGB快速模型[19]，这些工具提供了对绿色性和整体方法“纯度”的全面评估。鉴于样品制备对分析可持续性的关键影响，专门建立了如AGREE-Prep[20]和可持续性样品制备指标（SPMS）[21]等工具，以评估和指导更环保的预处理策略，确保所选方法最小化有害试剂的使用、减少能源消耗，并符合绿色化学的原则。
本工作的目标是根据FDA生物分析指南[22]，建立并全面验证一种稳健的绿色方法，用于测量大鼠血浆中Molnupiravir在其最大浓度（Tmax）时的含量。为了确保有效的分析物回收率和基质清洁度，独立应用了两种环保的样品清洗策略，即盐析辅助的液-液萃取和糖析辅助的液-液萃取，用于初次提取molnupiravir。除了分析性能外，还使用AGREE-Prep工具和可持续性样品制备指标（SPMS）系统地评估了样品制备的环保性，同时使用AGREE和RGB快速工具分别评估了所开发生物分析方法的整体环保性和“纯度”。这种综合方法不仅突出了该方法在药代动力学应用中的可靠性，还体现了其与绿色和可持续分析化学原则的一致性。
仪器
仪器
使用的HPLC设备是Dionex Ultimate 3000 UHPLC，配备二极管阵列检测器（DAD）和四元溶剂泵系统（美国马萨诸塞州）。使用的固定相是WATERS AXQUITY UPLC? BEH C8材料（2.1 × 150 mm，1.7 μm），来自美国米尔福德。样品由UHPLC自动采样器自动加入。
使用0.45 μm Millipore一次性膜过滤器（0.22 μm MS?）过滤用Rongtai可调体积微量移液器获得的样品。
结果与讨论
应用SALLE或SULLE进行Molnupiravir的萃取是一种有前景的方法，可以提高回收率、减少环境影响并提升分析性能。这种方法避免了蛋白质沉淀方法中常见的过度基质污染问题，后者常常导致色谱柱堵塞和降低测定重复性。这样的发展可以显著提高Molnupiravir的药代动力学研究、质量控制和治疗监测。
结论
本研究成功开发并优化了基于盐析和糖析的液-液微萃取方法，用于在HPLC分析之前从大鼠血浆中提取Molnupiravir。这两种方法都显示出高萃取回收率、最小的基质干扰，并符合FDA生物分析验证指南，证实了它们在药代动力学和治疗监测应用中的可靠性。比较优化表明，使用铵盐...
伦理批准和参与同意
Nahda大学的伦理委员会批准了该请求，参考编号为NUB-025-043。在进行研究时遵循了国际研究伦理指南。
致谢
作者感谢Princess Nourah bint Abdulrahman大学提供的支持，项目编号为PNURSP2025R917。
关于写作过程中生成式AI和AI增强技术的声明
在撰写本研究报告的过程中，作者使用了
QuillBot.com 来识别语法问题并提高内容的可读性。使用该工具或服务后，作者对出版物的内容负全责，并根据需要进行审查和更新。
数据和材料的可获取性
原始数据可根据合理请求从相关研究人员处获取。
CRediT作者贡献声明
Omkulthom Al Kamaly： 撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念构思。Nada S. Abdelwahab： 撰写 – 审稿与编辑、调查、数据分析、概念构思。Alaa A. Ahmed-Anwar： 撰写 – 初稿撰写、软件使用、资源准备。Michel Y. Fares： 撰写 – 初稿撰写、可视化、验证、方法设计、数据分析。
资金支持
本研究由Princess Nourah bint Abdulrahman大学的研究支持项目（项目编号PNURSP2026R917）资助，该大学位于沙特阿拉伯利雅得。
利益冲突声明
作者声明以下可能的财务利益/个人关系：Omkulthom Al Kamaly报告获得了Princess Nourah bint Abdulrahman大学的财务支持。Omkulthom Al Kamaly与Princess Nourah bint Abdulrahman大学之间存在关系，包括资金资助。如果有其他作者，他们声明没有已知的财务利益或可能影响研究结果的个人关系。
