《Advanced Science》：Detachment-Induced FAK-STAT3-NNMT Inhibits CTCs Anoikis to Promote Breast Cancer Metastasis by Enhancing Fatty Acid Oxidation
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本文揭示了循环肿瘤细胞（CTCs）在转移过程中抵抗失巢凋亡的关键机制。研究发现，CTCs在脱离细胞外基质（ECM）时，FAK-STAT3信号轴被激活，上调了烟酰胺N-甲基转移酶（NNMT）的表达。NNMT通过消耗甲基供体S-腺苷甲硫氨酸（SAM），抑制PP2A的甲基化，进而上调CD36和脂肪酸氧化（FAO）限速酶CPT1A的表达，增强脂肪酸氧化，维持细胞内的NADPH/NADP+平衡，促进活性氧（ROS）清除，最终帮助CTCs抵抗失巢凋亡。体内外实验表明，抑制NNMT或FAO可显著减少肺转移灶形成。本研究表明，靶向NNMT-FAO轴是抑制乳腺癌转移的潜在治疗策略。
1 NNMT在乳腺癌CTCs中表达上调
本研究在45例新诊断乳腺癌患者的血液样本中检测了CTCs。结果显示，在检测到CTCs的10例患者中，有9例的CTCs为NNMT阳性，比例高达90%。其中一例已发生远处转移的患者，其CTCs同样为NNMT阳性。在具有淋巴结转移的9例NNMT+CTCs患者中，有4例发生淋巴结转移，而NNMT?CTCs患者未见淋巴结转移。对GSE209998和GSE113890数据集的整合分析发现，CTCs和转移瘤中NNMT的mRNA表达水平显著高于原发瘤。在患者癌组织样本中也观察到，肿瘤浸润前沿的NNMT染色强度高于肿瘤原发灶。在体内小鼠模型中，从MDA-MB-231细胞构建的CTCs模型里分离出的CTCs，其NNMT表达也显著高于植入的肿瘤细胞。在体外悬浮培养模型中，与贴壁细胞相比，脱离细胞外基质的MDA-MB-231细胞中NNMT的mRNA和蛋白表达均显著上调。这些结果一致表明，NNMT在脱离细胞外基质的乳腺癌细胞中表达上调。
2 脱离诱导的NNMT上调由FAK-STAT3轴介导
当癌细胞脱离ECM时，整合素会招募并磷酸化FAK。生物信息学分析显示，在乳腺癌和泛癌中，FAK与STAT3的表达呈正相关。在悬浮培养的乳腺癌细胞中，磷酸化FAK（P-FAK）和磷酸化STAT3（P-STAT3）的蛋白水平均升高。用FAK抑制剂PF562271或P-STAT3抑制剂C188-9处理悬浮细胞，可显著下调NNMT的表达。而用STAT3激活剂Colivelin TFA处理，可部分恢复因FAK抑制导致的NNMT下调。通过染色质免疫共沉淀（ChIP）实验和双荧光素酶报告基因实验证实，P-STAT3可直接结合到NNMT的启动子区域，并激活其转录。以上结果表明，乳腺癌细胞脱离ECM后激活的FAK-STAT3信号轴，是诱导NNMT转录上调的关键机制。
3 NNMT诱导乳腺癌抵抗失巢凋亡并增加CTCs数量
为探究NNMT在失巢凋亡中的作用，研究构建了NNMT敲低的MDA-MB-231、BT-549细胞和NNMT过表达的MCF-7、HCC1937细胞模型。悬浮培养48小时后，NNMT过表达增加了细胞聚集体形成，而敲低则减少了聚集体。Western blot检测失巢凋亡标志物PARP和cleaved-caspase3，以及流式细胞术检测结果显示，NNMT敲低显著增加了悬浮细胞的凋亡比例，而过表达则显著降低了凋亡比例。软琼脂克隆形成实验表明，NNMT敲低减少了克隆数量，而过表达增加了克隆数量。在MDA-MB-231小鼠CTCs模型中，NNMT敲低组血液中检测到的CTCs数量显著少于对照组。这些结果证明，NNMT能够促进乳腺癌细胞抵抗失巢凋亡。
4 NNMT促进贴壁和脱离状态乳腺癌细胞的脂肪酸氧化
对CTCs与原发瘤的差异基因进行富集分析发现，脂肪酸氧化（FAO）通路是CTCs中显著上调的十大通路之一。对悬浮与贴壁MDA-MB-231细胞的RNA-seq进行KEGG分析也显示，差异基因富集于脂肪酸代谢通路。在乳腺癌队列中，NNMT表达与FAO通路评分呈正相关。通过Seahorse细胞能量代谢分析仪检测发现，NNMT敲低的BT-549细胞基础呼吸和最大呼吸能力下降，而NNMT过表达的MCF-7细胞最大呼吸能力升高。NNMT能够上调FAO限速酶CPT1A和脂肪酸转运蛋白CD36的mRNA和蛋白表达，且该作用不依赖于细胞贴壁状态。BODIPY染色实验进一步证实，NNMT促进了细胞的脂质摄取。这些结果表明，NNMT能够增强乳腺癌细胞的脂肪酸氧化。
5 NNMT通过抑制PP2A活性诱导FAO介导的失巢凋亡抵抗
研究发现，NNMT对其催化底物1-MNA的刺激不敏感，但其酶活性位点突变体（D197A， Y20A）丧失了对CPT1A和CD36的调控能力。LC-MS/MS检测显示，NNMT过表达显著降低了细胞内的SAM水平，而敲低则增加了SAM水平。已知SAM是蛋白质甲基化的通用甲基供体。PP2A的甲基化可增强其活性，而NNMT过表达降低了PP2A的甲基化水平，同时上调了下游的磷酸化AKT（P-AKT）和c-myc蛋白。c-myc是CPT1A的转录因子，而P-AKT可调控CD36。用c-myc抑制剂10074-G5或P-AKT抑制剂MK2206处理，可逆转NNMT对CPT1A和CD36的上调作用。用PP2A抑制剂冈田酸（OA）处理可模拟NNMT过表达的效果，而上调PP2A活性的奋乃静（PPZ）则产生相反作用。在功能上，用FAO抑制剂依托莫司（etomoxir）处理NNMT过表达的MCF-7细胞，可增加其失巢凋亡并减少软琼脂克隆；相反，用脂质混合物处理NNMT敲低的BT-549和MDA-MB-231细胞，则可减少其失巢凋亡并增加克隆形成。这证实了NNMT通过激活FAO来促进失巢凋亡抵抗。
6 NNMT介导的FAO通过维持氧化还原稳态诱导失巢凋亡抵抗
脱离ECM的细胞会积累更高水平的活性氧（ROS）。实验发现，NNMT敲低的悬浮BT-549细胞ROS积累更多，而过表达的MCF-7细胞ROS积累更少。用脂质混合物处理可降低NNMT敲低细胞的ROS水平，而用依托莫司处理则增加了NNMT过表达细胞的ROS水平。FAO是细胞NADPH的重要来源。检测发现，NNMT敲低细胞在悬浮状态下无法维持NADPH/NADP+的平衡，而过表达细胞能更好地维持该比例，且此效应可被依托莫司抑制。用ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）处理，可部分恢复NNMT敲低细胞在软琼脂中的克隆形成能力。这些结果表明，NNMT通过增强FAO来提供NADPH，清除ROS，从而帮助细胞抵抗失巢凋亡。
7 靶向NNMT-FAO轴可减少体内转移灶形成
在E0771小鼠肺转移模型中，NNMT过表达增加了肺转移结节数量，而联用依托莫司可抑制此效应。将荧光标记的MCF-7细胞尾静脉注射后24小时观察，NNMT过表达增加了肺内存活细胞数量，依托莫司处理则减少了该数量。在MDA-MB-231肺转移模型中，NNMT敲低或依托莫司治疗均显著减少了肺转移结节数量。此外，使用NNMT抑制剂（JBNSF-000088、姜黄素、香草醛）治疗，同样能显著抑制小鼠体内的乳腺癌转移。对转移瘤的免疫组化分析显示，NNMT过表达与CPT1A的高表达相关。这些体内实验证明，靶向NNMT-FAO轴能够有效抑制乳腺癌的转移。
结论
本研究发现，在脱离细胞外基质的乳腺癌细胞中，FAK-STAT3轴的激活诱导了NNMT的表达上调。NNMT通过消耗甲基供体SAM，抑制PP2A甲基化，从而解除PP2A对AKT和c-myc的抑制作用，最终上调CPT1A和CD36的表达，增强脂肪酸氧化。增强的FAO通过维持NADPH/NADP+平衡，有效清除ROS，帮助循环肿瘤细胞抵抗失巢凋亡，从而促进乳腺癌的远处转移。研究提示，NNMT-FAO轴是乳腺癌转移的关键调控枢纽，针对该轴进行干预（如使用NNMT抑制剂或FAO抑制剂）有望成为治疗转移性乳腺癌的新策略。
