靶向递送H2S纳米系统通过重塑铁蛋白自噬通路减轻脊髓损伤后的血-脊髓屏障破坏

《Advanced Science》：Targeted H2S Delivery System Attenuates Blood-Spinal Cord Barrier Disruption after Spinal Cord Injury by Reshaping the Ferritinophagy Pathway

本文报道了一种靶向递送H2S的纳米治疗新策略。研究人员构建了c(RGDyK)功能化的中孔聚多巴胺纳米粒（SPRC@MPDA-RGD），它能精准靶向脊髓损伤（SCI）后高表达αvβ3整合素的血管内皮细胞，在递送H2S前体SPRC的同时有效清除活性氧（ROS）。释放的SPRC上调胱硫醚γ裂解酶（CSE）以促进内源性H2S生成。机制上，H2S激活PI3K/Akt/mTOR通路，抑制由核受体共激活因子4（NCOA4）介导的铁蛋白自噬（ferritinophagy），减少铁蛋白降解和铁死亡（ferroptosis），从而有效修复血-脊髓屏障（BSCB），促进神经功能恢复，为SCI治疗提供了新思路。

引言：修复血-脊髓屏障是治疗脊髓损伤的关键挑战

脊髓损伤（SCI）是一种致残性的中枢神经系统疾病，每年新增病例超过70万，给患者和社会带来沉重负担。其病理进程分为原发性损伤和继发性损伤两个阶段。初始的机械性损伤会立即破坏神经元并破坏血-脊髓屏障（BSCB），导致炎性因子、细胞因子和血管活性肽渗入损伤部位，引发继发性损伤，加剧脊髓水肿和神经功能缺损。因此，针对BSCB早期完整性恢复的策略是限制继发损伤、改善神经功能结局的关键治疗途径。内皮细胞是BSCB的主要构成细胞，直接调控屏障的完整性。气体递质硫化氢（H₂S）在心血管领域表现出强大的内皮保护作用。然而，将H₂S转化为SCI治疗仍面临挑战。传统的无机供体（如NaHS）释放快速且不可控，会导致短期的细胞毒性H₂S峰值。内源性H₂S供体S-炔丙基-半胱氨酸（SPRC）通过上调胱硫醚γ裂解酶（CSE）表达来促进生理性H₂S生成，但受限于其快速的全身清除和较差的组织靶向特异性。中孔聚多巴胺纳米粒（MPDA）因其生物相容性、可降解性和通过丰富的酚羟基清除活性氧（ROS）的能力，成为一个理想的递送平台。其可调的中孔结构增强了载药能力，同时实现了缓释动力学。关键的突破点在于，SCI后新生血管内皮细胞上整合素α_vβ₃的上调，为具有高亲和力和特异性的环肽c(RGDyK)提供了靶点，可实现活性内皮靶向。基于此，研究人员设计并验证了SPRC@MPDA-RGD这一新型纳米治疗系统。

纳米粒的制备、表征与抗氧化性能

研究首先合成了MPDA纳米粒，透射电镜显示其具有均匀的中孔结构，平均尺寸约为220纳米。高角度环形暗场成像和元素映射进一步验证了其结构的均一性及碳、氧、氮元素的均匀分布。通过扩散法将SPRC有效载入MPDA的中孔中，形成SPRC@MPDA，随后进行c(RGDyK)表面功能化，得到SPRC@MPDA-RGD。高效液相色谱评估显示，当使用6 mg/mL剂量时，SPRC的负载效率高达27.93%。水合动力学直径和Zeta电位测试表明，功能化过程使纳米粒尺寸适度增加并在磷酸盐缓冲液中保持良好分散性与稳定性。SPRC@MPDA-RGD保留了MPDA固有的多种酶模拟活性。它能以浓度依赖性方式有效分解H₂O_{2>，展现出过氧化氢酶样活性。通过电子顺磁共振谱分析证实，它能有效清除由芬顿反应产生的羟基自由基（·OH）以及由黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶系统产生的超氧阴离子（·O2^-）。重要的是，SPRC的负载和c(RGDyK)的功能化并未损害MPDA核心固有的酶模拟活性，使其适用于SCI后的氧化微环境。}

体外验证：缓解内皮细胞氧化应激，修复血-脊髓屏障功能

已知SCI后内皮细胞会经历氧化应激，导致一系列功能障碍，加剧BSCB的破坏。通过CCK-8检测氧糖剥夺（OGD）干预下小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3的活力，确定50 μg/mL SPRC@MPDA-RGD具有最大的促活效果。细胞内H₂S含量测定显示，OGD后H₂S含量显著降低，MPDA处理未显著改善，而SPRC处理则使细胞内H₂S含量大幅恢复。评估SPRC@MPDA-RGD在氧化应激条件下对内皮细胞的保护作用，结果显示MPDA具有抗氧化特性，SPRC进一步缓解了内皮细胞的氧化应激，而两者合成的SPRC@MPDA-RGD能协同作用，降低内皮细胞内的ROS水平。蛋白质印迹法检测BSCB相关蛋白表达表明，单独的MPDA或SPRC仅能适度改善OGD引起的BSCB相关蛋白表达下降，而SPRC@MPDA-RGD可显著改善OGD引起的屏障损伤。免疫荧光染色显示类似结果，OGD后β-连环蛋白（β-Catenin）和闭合蛋白（Occludin）显著减少，而SPRC@MPDA-RGD处理显著增加了它们的表达。使用FITC-葡聚糖评估Transwell单层内皮模型通透性，发现OGD显著增加内皮通透性，而SPRC@MPDA-RGD有效降低了通透性。值得注意的是，SPRC@MPDA和SPRC@MPDA-RGD在改善氧化应激状态和修复OGD引起的BSCB相关蛋白损伤方面无显著差异，这可能提示在体外实验中，SPRC@MPDA无需c(RGDyK)肽即可有效结合内皮细胞并发挥作用。

体内靶向性验证：精准靶向脊髓损伤部位的血管内皮细胞

首先通过体内成像系统（IVIS）检测SPRC@MPDA-RGD的靶向特性。用荧光染料Cy5.5分别标记SPRC@MPDA和SPRC@MPDA-RGD，在损伤后第7天，少量SPRC@MPDA可在损伤部位积累，而c(RGDyK)修饰后的SPRC@MPDA-RGD则显著增强了在损伤部位的特异性积累，表明RGD修饰的纳米粒对脊髓病变区域的靶向能力增强。主要器官的离体成像显示，两者主要在肝脏积累。为了进一步证实SPRC@MPDA-RGD在BSCB中的靶向特异性，对损伤部位脊髓进行了CD31和整合素α_vβ₃的共染色。结果显示，整合素α_vβ₃在损伤后主要在内皮细胞上表达。此外，α_vβ₃、CD31与Cy5.5的共荧光染色显示，与SPRC@MPDA组相比，SPRC@MPDA-RGD组对SCI后损伤区域整合素阳性的血管内皮细胞的靶向性显著增强。生物安全性测试表明，SPRC@MPDA-RGD未引起明显的生物毒性。

体内治疗功效：促进脊髓修复并改善功能恢复

通过建立SCI模型并随后通过尾静脉注射给予SPRC@MPDA-RGD，评估了其体内治疗效果。通过BMS评分评估不同组小鼠的功能恢复，结果显示，所有组小鼠在SCI后立即瘫痪，随后在不同干预下表现出不同的恢复效果。与SCI组相比，给予SPRC@MPDA-RGD的小鼠在损伤后第7天BMS评分显著改善，且在损伤后两周，其功能恢复比SCI+SPRC@MPDA组小鼠改善更显著。斜面板测试得到了类似结果，表明SPRC@MPDA-RGD显著改善了小鼠损伤后的后肢运动功能，效果优于SPRC@MPDA。电生理学实验结果显示，与SPRC@MPDA-RGD治疗组的运动诱发电位（MEP）信号波幅高于其他治疗组。SCI后第7天的脊髓苏木精-伊红（HE）染色和尼氏（Nissl）染色表明，SPRC@MPDA-RGD显著减少了病变面积和尼氏体丢失。炎症相关细胞因子的检测热图显示，促炎细胞因子在SCI后显著增加，而抗炎细胞因子减少；SPRC@MPDA-RGD干预后，促炎细胞因子表达显著下调，抗炎细胞因子表达有效增加。这表明SPRC@MPDA-RGD能有效改善SCI后的炎症环境。使用二氢乙啶（DHE）染色评估脊髓内的氧化应激状态，结果显示SPRC@MPDA-RGD在减轻损伤后脊髓内ROS水平方面最有效。脊髓组织内H₂S含量检测显示，SCI后含量显著下降，但SPRC@MPDA-RGD有效逆转了这一趋势。值得注意的是，SPRC@MPDA-RGD在促进运动功能恢复、改善炎症环境、减轻氧化应激和恢复H₂S水平方面，统计学上优于SPRC@MPDA。电生理学实验和病理学检查也表明，在促进SCI后恢复方面，SPRC@MPDA-RGD比SPRC@MPDA更有效。这些结果表明，c(RGDyK)显著提高了SPRC@MPDA的递送效率，从而增强了损伤后的治疗效果。

体内功效验证：减轻脊髓损伤后的血-脊髓屏障破坏

伊文思蓝（EB）渗出实验表明，SPRC@MPDA-RGD有效减弱了损伤引起的BSCB通透性升高。损伤后第7天收集脊髓样本，通过蛋白质印迹法评估组间BSCB相关蛋白的差异。结果显示，SPRC@MPDA-RGD有效缓解了SCI引起的BSCB相关蛋白（包括β-Catenin、ZO-1、Claudin5和Occludin）的丢失，并恢复了它们的表达。β-Catenin和Occludin的双标免疫荧光分析结果进一步证实了这些发现。总之，SPRC@MPDA-RGD可以改善SCI后的BSCB功能，提供有效保护。

转录组学分析揭示治疗后的基因表达与通路调控

为了探索SCI后的差异表达基因（DEGs）并研究SPRC@MPDA-RGD治疗效果的分子机制，对假手术组（Sham）、SCI组和SCI+SPRC@MPDA-RGD组小鼠的脊髓样本进行了批量RNA测序（RNA-seq）。主成分分析（PCA）显示三组之间明显分离，SCI+SPRC@MPDA-RGD组位于两组之间，表明治疗使转录组景观向恢复状态转变。维恩图展示了假手术组与SCI组、SCI组与SCI+SPRC@MPDA-RGD组比较之间DEGs的重叠情况。共有3036个基因（36.0%）是两组比较共有的，代表在SCI中失调并随后受治疗影响的基因。SCI组与假手术组比较的火山图显示3237个基因上调和2158个基因下调，表明SCI对基因表达有显著影响。而SCI+SPRC@MPDA-RGD组与SCI组比较显示594个基因上调和834个基因下调。DEGs交集的热图显示，SCI组与假手术组相比表现出广泛的基因表达变化，而SCI+SPRC@MPDA-RGD组显示出部分恢复的基因表达模式，表明治疗调节了损伤诱导的转录失调。铁蛋白是主要的铁储存蛋白，通过储存和释放铁离子在铁稳态中发挥关键作用。在本研究中，与假手术组相比，SCI组的铁蛋白轻链1（Ftl1）mRNA表达上调，而在SCI+SPRC@MPDA-RGD组得到恢复。基于排名基因列表的基因集富集分析（GSEA）结果显示，铁死亡通路在SCI后显著富集，SPRC@MPDA-RGD的治疗效果可能与铁死亡有关。这些发现表明，SPRC@MPDA-RGD治疗可以显著改变对SCI的转录反应，并通过调节关键损伤相关基因网络对BSCB产生保护作用。

机制探究一：SPRC@MPDA-RGD减轻OGD诱导的内皮细胞铁死亡

研究人员首先检测了不同组内皮细胞的活力。OGD显著降低了bEnd.3细胞的活力，而SPRC@MPDA-RGD显示出强大的恢复能力，与SPRC@MPDA相似，且显著优于其他单一成分。随后评估了铁死亡的两个重要标志：不稳定亚铁离子（Fe²⁺）水平和脂质过氧化水平。使用亚铁离子比色检测试剂盒和FerroOrange荧光染色评估bEnd.3细胞内的Fe²⁺水平。OGD干预后，bEnd.3细胞内Fe²⁺水平大幅增加。MPDA和SPRC都能适度降低Fe²⁺水平并发挥协同作用，其中SPRC@MPDA-RGD组的Fe²⁺水平降低最显著。通过C11-BODIPY探针检测不同组的脂质过氧化水平，OGD后脂质ROS水平增加，而SPRC@MPDA-RGD显著缓解了这一现象。此外，还评估了关键的铁死亡指标，包括超氧化物歧化酶（SOD，一种抑制ROS的酶）和丙二醛（MDA，脂质过氧化的终产物）。结果显示，OGD组SOD活性降低，MDA含量水平升高，而SPRC@MPDA-RGD显著缓解了这一过程。总之，SPRC@MPDA-RGD可有效缓解OGD引起的铁死亡。值得注意的是，单一成分MPDA或SPRC也表现出中度的铁死亡抑制活性，这可能归因于MPDA对Fe离子的螯合能力以及SPRC释放的H₂S对内皮细胞铁死亡的抑制作用。结果表明，这两种成分可以发挥协同作用，SPRC@MPDA-RGD复合物表现出强大的铁死亡抑制活性。最后，通过蛋白质印迹法检测了不同组中铁蛋白重链（FTH）和铁蛋白轻链（FTL）的表达。结果显示OGD后FTH和FTL均显著下降，表明铁蛋白大量减少，铁被释放到不稳定铁池中，可能导致铁超载，这可能是OGD诱导内皮细胞铁死亡的重要因素。为了确定SPRC@MPDA-RGD对BSCB的保护是否通过抑制铁死亡介导，研究人员使用铁死亡诱导剂RSL3进行了进一步研究。SPRC@MPDA-RGD对BSCB的保护作用可被RSL3逆转，证明其治疗效果是通过抑制铁死亡实现的。

机制探究二：SPRC@MPDA-RGD抑制OGD诱导的铁蛋白自噬

铁蛋白已被证明参与铁蛋白自噬和细胞铁递送。基于批量RNA-seq进行KEGG通路分析，以进一步研究SPRC@MPDA-RGD调节铁死亡的潜在分子机制。SPRC@MPDA-RGD响应基因在PI3K-Akt信号通路中富集。作为调节自噬的经典通路，其在激活后通过靶向下游靶点mTOR来抑制该过程。先前研究表明，H₂S通过激活PI3K/Akt/mTOR通路从而抑制自噬，对神经功能恢复发挥保护作用。这些结果表明，SPRC@MPDA-RGD抑制铁死亡的能力可能是通过PI3K/Akt/mTOR介导的自噬调节来实现的。铁蛋白自噬是最近揭示的一种选择性自噬，对于连接自噬和铁死亡通路至关重要。在核受体共激活因子4（NCOA4）的调节下，铁蛋白可被转运至溶酶体并降解，将铁释放到不稳定铁池中，引发铁死亡。这个过程对维持铁稳态至关重要。首先检测了CSE的蛋白表达水平，MPDA对CSE的激活没有贡献，而SPRC有效增加了bEnd.3细胞中CSE的表达水平。FTH和FTL表达的蛋白质印迹结果提示铁蛋白可能发生了降解，SPRC@MPDA-RGD可能通过铁蛋白自噬保护BSCB功能。因此，检测了参与自噬的蛋白。结果显示，