《Advanced Science》：In Vivo CRISPR Screening Identifies the Glutamate Receptor GRIA2 as Promoting Peritoneal Metastasis of Gastric Cancer via Calcium-Dependent β-Catenin Activation
编辑推荐：
本研究通过体内全基因组CRISPR筛选，鉴定出谷氨酸受体GRIA2是驱动胃癌腹膜转移的关键因子。研究发现，肿瘤微环境中癌相关成纤维细胞（CAF）分泌的谷氨酸通过激活GRIA2，增强其与GSK-3β的相互作用并诱导钙内流，从而抑制GSK-3β激酶活性、稳定β-连环蛋白（β-catenin），最终激活Wnt/β-连环蛋白信号通路，促进胃癌细胞的迁移、侵袭、干性和腹膜黏附。研究在临床样本、患者来源类器官（PDO）和多种小鼠模型中验证了该机制，并提出AMPA受体拮抗剂（如NBQX和Selurampanel）是潜在的治疗策略。该研究为理解胃癌腹膜转移提供了新见解，并揭示了GRIA2作为治疗靶点和预后生物标志物的潜力。
2.1 全基因组CRISPR筛选鉴定GRIA2是胃癌腹膜转移的关键驱动因子
腹膜转移是胃癌最致命的转移形式，中位生存期不足一年。为了系统性、无偏倚地寻找驱动基因，研究者利用人基因组规模CRISPR敲除（GeCKO）v2文库，对胃癌细胞系MKN74进行全基因组CRISPR/Cas9功能缺失筛选。将突变细胞库注射至裸鼠腹腔建立腹膜转移模型，并收集转移灶进行测序分析。通过MAGeCK-RRA算法，在显著耗竭的基因中，鉴定出谷氨酸受体GRIA2（AMPA型谷氨酸受体亚基2）是排名靠前的候选驱动基因。生存分析显示，GRIA2高表达与胃癌患者的不良预后显著相关。
在体外实验中，选择了内源性GRIA2表达较高的MKN74和MKN45细胞进行敲除，并在GRIA2表达较低的鼠源YTN16细胞中进行过表达。体内实验结果表明，GRIA2敲除显著降低了腹腔肿瘤的生物发光信号强度和转移结节数量，而GRIA2过表达则显著加剧了腹膜转移负担，验证了其在胃癌腹膜转移中的促进作用。
2.2 GRIA2以谷氨酸依赖的方式促进胃癌细胞的迁移、侵袭、干性和腹膜黏附
功能学实验表明，GRIA2敲除显著削弱了胃癌细胞的迁移、侵袭、成球（干细胞样特性）以及对人腹膜间皮细胞的黏附能力，而过表达GRIA2则增强了这些恶性表型。由于GRIA2是离子型谷氨酸受体的亚基，研究者进一步探讨了其功能是否依赖于其配体谷氨酸。在不同浓度谷氨酸（0、50、100 μM）条件下，研究者发现，在没有谷氨酸时，GRIA2的表达变化对细胞表型几乎没有影响。然而，随着谷氨酸浓度增加，对照细胞的迁移、侵袭、成球和黏附能力逐渐增强，这种增强效应在GRIA2过表达细胞中更为显著，而在GRIA2敲除细胞中被削弱。这表明GRIA2对胃癌细胞恶性行为的促进作用是谷氨酸依赖性的。
2.3 GRIA2通过激活Wnt/β-连环蛋白通路驱动胃癌的转移表型
为了阐明GRIA2的分子机制，研究者对GRIA2敲除和对照MKN74细胞进行了RNA测序。差异表达基因的GO富集分析显示，GRIA2敲除后，与上皮-间质转化、细胞黏附及Wnt信号通路负调控等癌症相关通路相关的基因显著富集。基因集富集分析进一步证实，GRIA2敲除导致Wnt信号通路被显著抑制。在胃癌细胞中进行的TOPFlash报告基因实验也证明，GRIA2敲除下调、而过表达上调了经典Wnt信号通路的转录活性。
研究者发现，GRIA2不影响β-连环蛋白的mRNA水平，但在蛋白水平上，GRIA2敲除导致β-连环蛋白减少，而过表达使其增加，表明GRIA2在翻译后水平稳定β-连环蛋白。蛋白质合成抑制剂放线菌酮处理实验表明，GRIA2敲除加速了β-连环蛋白的降解，而过表达延缓了其降解。功能挽救实验显示，表达一个不能被降解的、持续活化的β-连环蛋白S33Y突变体，可以挽救GRIA2敲除导致的细胞迁移、侵袭、成球和黏附能力的缺陷。相反，在GRIA2过表达的细胞中敲低β-连环蛋白，则抑制了这些恶性表型。这些结果证明，β-连环蛋白的稳定介导了GRIA2驱动的转移表型。
2.4 GRIA2通过与GSK-3β物理相互作用，并经由钙内流抑制其激酶活性以稳定β-连环蛋白
为了探究GRIA2如何影响Wnt/β-连环蛋白通路，研究者通过免疫沉淀-质谱联用技术发现GRIA2与糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）存在强烈相互作用，该相互作用在谷氨酸处理后进一步增强。分子动力学模拟显示，谷氨酸结合可增强GRIA2与GSK-3β复合物的结合亲和力与稳定性，并鉴定出R715是GRIA2与GSK-3β结合的关键氨基酸位点。
GSK-3β的活性受多个位点的磷酸化调节：Ser9磷酸化抑制其活性，而Tyr216磷酸化激活其活性。Western blot分析发现，GRIA2敲除降低了GSK-3β的Ser9磷酸化水平，增加了Tyr216磷酸化水平，总体导致GSK-3β激酶活性升高；GRIA2过表达则产生相反效应。体外激酶活性测定也证实了这一点。通过使用GSK-3β抑制剂氯化锂（LiCl）和激活剂DIF-3进行的药理学实验，进一步支持了GRIA2通过调节GSK-3β活性来影响β-连环蛋白稳定性的结论。
关键的机制在于，GRIA2介导钙内流。GRIA2在Q/R编辑位点（人类为Q607位点）的RNA编辑决定了其钙离子通透性。未经编辑的GRIA2（Q型）允许钙离子内流。研究者在胃癌细胞中发现GRIA2主要是未经编辑的Q型。钙离子检测实验表明，GRIA2敲除减少、而过表达增加了钙离子内流。更重要的是，在钙离子存在的条件下，过表达野生型GRIA2能够抑制GSK-3β活性并激活Wnt信号，而过表达钙离子不通透的Q607R突变体则不能。在无钙培养基中，GRIA2的调控效应消失。这些证据共同阐明了一条信号轴：CAF分泌的谷氨酸激活肿瘤细胞上的GRIA2，导致钙内流，进而抑制GSK-3β激酶活性，稳定β-连环蛋白，最终激活Wnt信号通路。
2.5 AMPA受体拮抗剂在临床前模型中抑制胃癌腹膜转移
鉴于GRIA2的关键作用，研究者评估了选择性AMPA受体拮抗剂NBQX和Selurampanel的治疗潜力。体外实验显示，两种拮抗剂均能以剂量依赖的方式抑制胃癌细胞的迁移、侵袭、成球和腹膜黏附能力。
研究者还利用来自胃癌腹膜转移患者的、具有不同GRIA2表达水平的患者来源类器官（PDO）模型进行评估。结果显示，GRIA2高表达的类器官呈现出侵袭性分枝状结构，而GRIA2低表达的类器官则形成光滑的球状结构。NBQX或Selurampanel处理可显著缩小GRIA2高表达类器官的体积并减少其分枝结构，同时降低其β-连环蛋白表达，但对GRIA2低表达类器官影响甚微。
最后，在细胞系来源的腹膜转移小鼠模型和患者来源类器官异种移植（PDOX）模型中进行体内药效评估。结果显示，NBQX或Selurampanel治疗显著降低了GRIA2高表达肿瘤的腹腔转移负担和结节数量，而对GRIA2低表达的肿瘤转移抑制效果不显著。这表明AMPA受体拮抗剂的疗效具有GRIA2依赖性，GRIA2表达水平可能作为疗效预测的生物标志物。
2.6 癌相关成纤维细胞来源的谷氨酸驱动GRIA2介导的腹膜转移
为了探究肿瘤微环境中谷氨酸的来源，研究者对5例胃癌腹膜转移样本进行了单细胞RNA测序。分析发现，关键的谷氨酸转运蛋白SLC17A7（VGluT1）主要在成纤维细胞中高表达。通过流式细胞术分选不同细胞群体并检测其分泌的谷氨酸，证实癌相关成纤维细胞（CAF）是腹膜微环境中谷氨酸的主要来源。
为了在功能上验证CAF来源谷氨酸的作用，研究者构建了成纤维细胞特异性Slc17a7（编码VGluT1）条件性敲除小鼠。实验发现，野生型CAF的条件培养基可显著增强GRIA2过表达胃癌细胞的迁移、侵袭、成球和黏附能力，并调控GSK-3β磷酸化和β-连环蛋白水平。然而，来自Slc17a7敲除CAF的条件培养基则无法产生这些效应。体内实验进一步证实，在Slc17a7野生型小鼠中，GRIA2过表达显著促进了腹膜转移；而在Slc17a7敲除小鼠中，腹膜转移被显著抑制，且GRIA2过表达不再能促进转移。这些结果确立了CAF-谷氨酸-GRIA2轴在驱动腹膜转移中的关键作用。
2.7 临床腹膜转移灶中GRIA2高表达与Wnt通路激活及不良预后相关
为了评估GRIA2的临床相关性，研究者对51例胃癌腹膜转移患者的组织样本进行了分析。免疫荧光结果显示，76%的腹膜转移灶呈现GRIA2高表达。免疫组化分析发现，GRIA2高表达的转移灶中，β-连环蛋白和磷酸化GSK-3β（Ser9）的水平也显著升高，且GRIA2表达与这两者均呈正相关。生存分析显示，GRIA2高表达的腹膜转移患者总生存期显著短于GRIA2低表达患者。这些临床数据将基础研究发现与患者预后联系起来，证实了GRIA2在胃癌腹膜转移中的驱动作用及其作为预后生物标志物的潜力。
3 讨论与结论
本研究通过体内CRISPR筛选，首次将经典的神经递质受体GRIA2与胃癌腹膜转移联系起来，并阐明了一个全新的信号机制：肿瘤微环境中CAF分泌的谷氨酸，通过激活肿瘤细胞上的GRIA2，引发钙内流；钙离子增强GRIA2与GSK-3β的相互作用并直接抑制其激酶活性，从而稳定β-连环蛋白，激活Wnt信号通路，最终驱动胃癌细胞的转移相关表型。这一“CAF-谷氨酸-GRIA2-钙-GSK-3β-β-连环蛋白”信号轴的发现，为理解胃癌腹膜转移的分子机制提供了新视角。
在转化医学意义上，研究证实了两种临床阶段（用于神经系统疾病）的AMPA受体竞争性拮抗剂NBQX和Selurampanel，在体外、类器官及多种体内模型中能够有效抑制GRIA2依赖的腹膜转移。这提示，靶向GRIA2或AMPA受体是治疗胃癌腹膜转移的潜在新策略，且GRIA2表达水平可能用于筛选潜在获益患者。当然，将神经药物重新用于癌症治疗仍需克服剂量、药代动力学及神经系统副作用等挑战。
总之，本研究不仅揭示了GRIA2驱动胃癌腹膜转移的分子机制，也为其作为治疗靶点和预后标志物提供了坚实证据，为改善这一致命性疾病的治疗带来了新希望。
