一种用于实时可视化肿瘤相关巨噬细胞重编程的NO激活型NIR-II纳米诱导剂及其抗肿瘤应用

《Advanced Science》：Real-Time In Vivo Visualization of Tumor-Associated Macrophage Reprogramming Using a Nitric Oxide-Activatable NIR-II Nanoinducer

本研究开发了一种一氧化氮（NO）激活型近红外二区（NIR-II）荧光/光声纳米诱导剂（I/E@M2pep），能够特异性靶向M2型肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），并将其重编程为具有抗肿瘤作用的M1表型，同时通过比率型光声成像实现对巨噬细胞重编程过程的实时、在体可视化。该策略与CD47单抗联用，可显著增强抗肿瘤免疫，为肿瘤免疫治疗与治疗监测提供了新思路。

　　

2.1 I/E@M2pep的设计与表征

本研究设计并构建了一种名为I/E@M2pep的NO激活型NIR-II纳米诱导剂，用于在实现抗肿瘤治疗的同时，对肿瘤相关巨噬细胞的重编程过程进行实时、在体可视化。该纳米诱导剂由三个功能单元构成：1）用于靶向M2型TAMs的M2pep肽；2）能通过抑制PI3Kγ信号通路将M2型TAMs重编程为M1表型的小分子药物IPI549；3）可被M1型巨噬细胞产生的一氧化氮（NO）激活的NIR-II探针（ETNO）。透射电镜和动态光散射分析显示，I/E@M2pep呈规则球形，粒径约为110纳米。该纳米颗粒在多种溶剂和pH条件下均表现出良好的稳定性。光学性质测试表明，ETNO在二甲亚砜中的最大吸收和发射波长分别为887纳米和1045纳米，与NO反应后其分子内电荷转移效应被阻断，光学性质发生改变，具体表现为808纳米处的吸收峰降低，而在1064纳米处出现新的吸收峰。这种光谱变化使得通过比率型光声信号PA_{1064 nm}/PA_{808 nm}来量化NO成为可能，检测限低至0.19微摩尔。选择性实验证实，I/E@M2pep仅对NO有特异性荧光和光声信号响应，而对其他多种离子、氨基酸和活性氧物种无明显反应，确保了其在复杂生物环境中的检测特异性。

2.2 纳米诱导剂在体外对巨噬细胞的重编程与监测能力评估

为验证纳米诱导剂的靶向性，研究将FITC标记的纳米颗粒与不同细胞共孵育。结果显示，修饰了M2pep的I/E@M2pep能特异性靶向并富集于M2型巨噬细胞，而未修饰的纳米颗粒则无此现象。在重编程功能方面，用I/E@M2pep处理经预极化的M2型巨噬细胞（包括RAW264.7细胞和小鼠骨髓来源巨噬细胞BMDMs）24小时后，流式细胞术分析显示，与对照组相比，处理组细胞的M1表型标志物显著增加，M2标志物相应减少，M1/M2比率提升了10.4倍，证实了其高效的重编程效果。为了建立光声信号与巨噬细胞表型的关联，研究将I/E@M2pep与不同M1/M2比例的巨噬细胞混合物共孵育。结果表明，在纯M2环境中，由于NO水平极低，探针未被激活，PA_{1064 nm}/PA_{808 nm}比率约为0.08；而在纯M1环境中，探针被NO显著激活，比率信号接近1。这表明比率型光声信号的变化可用于实时监测巨噬细胞的重极化过程。

2.3 M2巨噬细胞重编程的体内荧光/光声双模态成像

在4T1荷瘤小鼠模型中，静脉注射I/E@M2pep后，纳米颗粒随时间在肿瘤部位逐渐积累，NIR-II荧光信号在注射后6小时达到峰值。在808纳米激发下，无论小鼠是否接受重编程药物，肿瘤部位的初始光声信号强度相似。然而，在1064纳米激发下，接受药物治疗的小鼠肿瘤产生了明显更强的光声信号，这表明由重编程后的M1型巨噬细胞产生的NO与ETNO反应，激活了1064纳米处的信号。通过三维光声成像，进一步证明了该纳米诱导剂能够实时监测不同肿瘤深度截面上M1型巨噬细胞的浸润情况。为了评估比率型光声信号与巨噬细胞重极化程度的相关性，研究对肿瘤组织进行了流式细胞术分析。在接受了IPI549重编程治疗的小鼠中，肿瘤内M1型巨噬细胞浸润增加了约3倍，而M2型TAMs减少了约2倍。同时，肿瘤部位的比率型光声信号PA_{1064 nm}/PA_{808 nm}与M1/M2比率呈线性相关。此外，通过受试者工作特征曲线分析确定的截断值为0.823，可用于通过比率型光声信号准确评估巨噬细胞的重极化效果。这些发现证实了该纳米诱导剂在体内实时追踪TAMs重编程方面的潜力。

2.4 I/E@M2pep重塑肿瘤微环境以增强抗肿瘤效果

TAMs表型从M2向M1的转变，导致了其功能从促瘤向抑瘤的转换。研究首先在体外评估了重编程后巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬功能及细胞因子分泌水平的变化。由于肿瘤细胞高表达“别吃我”信号CD47，实验设置了联合使用CD47单克隆抗体的组别。结果显示，经I/E@M2pep重编程的巨噬细胞，在联合CD47单抗后，对肿瘤细胞的吞噬作用显著增强。酶联免疫吸附测定显示，经I/E@M2pep处理后，M1相关细胞因子肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6的分泌水平显著升高，而免疫抑制分子白细胞介素-10和转化生长因子-β的水平下降，这有助于缓解细胞外基质屏障并改善抗肿瘤免疫应答。基于I/E@M2pep优异的巨噬细胞重编程效能，研究进一步探讨了其对体内肿瘤微环境重塑和抗肿瘤活性的影响。结果显示，I/E@M2pep治疗组中M2型巨噬细胞标志物CD206显著减少，M1型标志物CD80显著增加，与CD47单抗联用后效果更为显著。联合治疗组中胶原蛋白表达降低，同时伴随T细胞浸润和颗粒酶B的增加，表明抗肿瘤免疫应答得到显著改善。组织学分析进一步证实，纳米诱导剂联合CD47单抗治疗组中肿瘤细胞凋亡增加。这些结果表明，I/E@M2pep通过原位巨噬细胞重编程联合CD47阻断，重塑了肿瘤微环境，从而增强了抗肿瘤免疫力。通过肿瘤组织的RNA测序分析进一步评估了联合疗法诱导的肿瘤微环境变化。与磷酸盐缓冲盐水对照组相比，I/E@M2pep联合CD47单抗组有474个基因上调，444个基因下调。基因本体富集分析显示，与细胞粘附、白细胞迁移、细胞外基质组织等过程相关的条目显著富集。京都基因与基因组百科全书通路分析排名前20的通路中，突出了免疫细胞迁移、抗肿瘤免疫应答和细胞外基质重塑。重要的是，基因集富集分析表明，吞噬作用、一氧化氮合成、胶原代谢和抗肿瘤免疫应答等通路在联合治疗组中显著上调。综合来看，RNA测序结果提示I/E@M2pep联合CD47单抗可能通过重塑肿瘤微环境和增强抗肿瘤免疫应答来促进肿瘤清除。此外，在主要器官中未观察到明显的组织病理学毒性，血液学毒性可忽略不计，支持了该纳米诱导剂良好的生物安全性。

3 结论

总而言之，本研究开发了一种新型的NO激活型NIR-II纳米诱导剂I/E@M2pep，用于在体可视化TAMs重编程并增强实体瘤治疗。I/E@M2pep通过简便的自组装法制备。其中，M2pep赋予其对M2型TAMs的选择性靶向能力；PI3Kγ抑制剂IPI549诱导M2型TAMs向M1样表型转化并伴随NO产生；ETNO探针则通过NIR-II荧光/光声成像实现巨噬细胞重极化的在体可视化。这种靶向激活、具有深层组织穿透能力的NIR-II成像策略显著提高了体内检测的特异性和灵敏度，获得了高信噪比。通过比率型光声信号，可以准确评估巨噬细胞的重极化效果。此外，将该纳米诱导剂与CD47单抗联用，可通过M1型巨噬细胞介导的肿瘤杀伤和肿瘤微环境重塑来增强抗肿瘤免疫。该策略可扩展应用于监测肿瘤发生、转移和治疗反应，从而有助于阐明TAMs在肿瘤进展和治疗结果中的作用。