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本研究揭示了一个全新的神经保护机制。研究人员发现，在多肽N-乙酰半乳糖胺转移酶3（GALNT3）的过表达能够通过O-GalNAc糖基化作用稳定骨髓细胞触发受体2（TREM2）蛋白，从而抑制小胶质细胞的M1型极化、减轻神经炎症与氧化应激，最终在小鼠脑缺血-再灌注损伤（CIRI）模型中发挥神经保护作用。该研究为CIRI的治疗提供了潜在的新靶点。
脑缺血-再灌注损伤（CIRI）的复杂性与治疗挑战
缺血性脑卒中是全球范围内导致患者严重残疾和死亡的重要原因，构成沉重的社会经济负担。目前全球公认的治疗策略是快速血流重建，包括静脉溶栓和血管内介入机械取栓。然而，即使部分患者得到及时治疗并实现了血流再通，脑组织仍会遭受不可逆的损伤，甚至比预期的损伤更为严重，这种现象主要是由脑缺血-再灌注损伤所导致。CIRI的发病机制复杂，涉及一系列复杂的病理生理过程，包括炎症、氧化应激、细胞凋亡和铁死亡等。其中，炎症免疫反应中的小胶质细胞近年来受到广泛关注。经典激活的M1型小胶质细胞具有强大的吞噬和细胞毒性，在极化后促进IL-1β、IL-6、IFN-γ等炎症介质以及iNOS和ROS的分泌，导致神经元功能障碍、损伤和变性。此外，氧化应激在CIRI发病机制中的作用也不容忽视。恢复缺血组织的血液供应，在恢复有氧代谢的同时，也会导致ROS的产生超过脑组织的清除能力，从而引发氧化应激。这些因素在CIRI的发展过程中相互交织，最终导致脑组织神经元死亡。目前，尚未建立起有效的治疗措施来预防再灌注引起的进一步损伤。
蛋白质的糖基化修饰在调控生物分子稳定性和活性中扮演关键角色。其中，O-GalNAc糖基化是最常见的O-糖基化修饰之一，通常存在于膜蛋白和分泌蛋白中。多肽N-乙酰半乳糖胺转移酶3（GALNT3）是乙酰半乳糖胺家族成员，作为粘蛋白型O-糖基化的起始酶，可将N-乙酰半乳糖胺转移到丝氨酸或苏氨酸残基的羟基上，形成Tn抗原。已有研究表明，GALNT3能够缓解血管钙化并抑制炎症因子的分泌，在炎症和小胶质细胞极化方向上具有潜在作用。本研究通过建立体内小鼠短暂性大脑中动脉闭塞/再灌注（tMCAO/R）模型和体外氧-糖剥夺/复氧（OGD/R）诱导的细胞模型，全面评估了GALNT3在CIRI中的作用及其可能的分子机制。
GALNT3是CIRI中下调的关键基因
为了探究CIRI中的转录组变化，研究首先对假手术组和tMCAO/R小鼠的脑组织进行了mRNA测序。差异表达分析（adj p < 0.01，|log2FC| > 2）鉴定出一组显著失调的基因。研究人员主要关注差异表达的下调基因。功能富集分析显示，这些下调基因在胶原蛋白细胞外基质、分泌颗粒等方面富集，并与细胞因子介导的信号通路、糖蛋白代谢过程、细胞因子结合和碳水化合物结合等生物过程或分子功能密切相关。KEGG分析表明，这些基因与细胞外基质-受体相互作用和细胞因子-细胞因子受体相互作用等15条通路显著相关。鉴于炎症反应是CIRI的核心病理事件，而O-糖基化是调节蛋白质稳定性并参与炎症调节的最常见翻译后修饰之一，研究重点聚焦于糖基化与CIRI的交集。在糖基化相关通路中，GALNT3和GALNT6显著富集。使用筛选差异表达基因的标准，发现GALNT3和GALNT6在tMCAO/R小鼠的梗死周边皮质中均显著下调。鉴于GALNT3显示出稍大幅度的下调，且先前报道其具有抗炎作用并能抑制小胶质细胞极化，因此研究优先对GALNT3进行功能探索，并假设GALNT3可能在改善CIRI神经损伤中发挥作用。
GALNT3过表达改善tMCAO/R小鼠的神经功能缺损
为了确定GALNT3是否影响CIRI期间的脑损伤，在tMCAO/R手术前一周，向C57BL/6小鼠右侧脑室注射GALNT3过表达或对照慢病毒。与假手术组相比，GALNT3在tMCAO/R小鼠的梗死周边皮质组织中受到抑制，但GALNT3的过表达逆转了这一现象。此外，通过免疫荧光双染进一步验证了慢病毒介导的GALNT3在小鼠脑组织小胶质细胞中的过表达。小鼠模型的Longa评分结果显示，tMCAO/R导致神经功能下降，但GALNT3过表达部分恢复了神经功能。进一步研究发现，tMCAO/R诱导了更严重的脑水肿和梗死体积，而GALNT3过表达在很大程度上逆转了这些现象。这些结果表明，GALNT3有助于改善tMCAO/R治疗小鼠的神经功能缺损。
GALNT3抑制tMCAO/R小鼠的神经元凋亡和氧化应激
研究人员进一步评估了GALNT3对tMCAO/R小鼠神经元凋亡和氧化应激的作用。通常，神经元变性常发生在CIRI的早期阶段。通过FJC染色检测GALNT3对tMCAO/R小鼠缺血半暗带神经元变性的影响。研究发现，与假手术组相比，tMCAO/R组的FJC荧光强度显著增加，但GALNT3治疗后显著降低。此外，GALNT3的过表达在一定程度上抑制了神经元凋亡。越来越多的研究表明，再灌注导致大量有害的ROS产生，引发氧化应激，这是造成大部分缺血-再灌注脑损伤的原因。通过DHE染色发现，GALNT3过表达逆转了tMCAO/R处理引起的ROS过量产生。数据还显示，tMCAO/R小鼠中丙二醛（MDA）的积累与氧化应激程度呈正相关，但GALNT3显著抑制了这一趋势。此外，tMCAO/R处理导致谷胱甘肽（GSH）/氧化型谷胱甘肽（GSSG）比值和超氧化物歧化酶（SOD）活性下降，但GALNT3恢复了这些数值。总体而言，数据表明GALNT3抑制了tMCAO/R小鼠的神经元凋亡和氧化应激。
GALNT3抑制tMCAO/R小鼠的炎症和小胶质细胞M1极化
进一步确定了GALNT3在CIRI进展中对炎症和小胶质细胞M1极化的作用。具体而言，研究了CD16/32、iNOS、TNF-α和IL-6的水平，这些都是小胶质细胞M1活化和脑组织炎症的标志物。GALNT3显著抑制了tMCAO/R处理小鼠梗死组织中CD16/32荧光强度的增加。在另一种M1型小胶质细胞标记物iNOS的表达中也观察到了类似的趋势。最后，检测了GALNT3对CIRI诱导的炎症的影响。IL-6和TNF-α的水平在CIRI损伤后显著升高，但GALNT3过表达抑制了这些炎症因子的表达。总之，结果表明GALNT3抑制了tMCAO/R小鼠的炎症和小胶质细胞M1极化。
GALNT3抑制OGD/R诱导的小胶质细胞炎症反应和M1极化
为了进一步证实GALNT3参与CIRI，将小胶质细胞HMC-3细胞暴露于OGD/R以模拟体内缺血性损伤。首先分别通过qPCR和蛋白质印迹验证了GALNT3过表达慢病毒的感染效率。此外，与正常细胞相比，GALNT3表达在OGD/R处理的HMC-3细胞中受到抑制，但被GALNT3过表达所逆转。随后评估了体外小胶质细胞的M1极化和炎症反应。CD16/32和iNOS的表达在OGD/R处理的小胶质细胞中显著上调，但被GALNT3的过表达所抑制。此外，GALNT3降低了OGD/R刺激引起的IL-6和TNF-α水平升高，这与体内结果反映的趋势一致。为了进一步确认GALNT3的功能必要性，使用shRNA敲低了HMC-3细胞中的GALNT3。在OGD/R处理的细胞中，GALNT3敲低进一步增强了M1标记物CD16/32和iNOS的表达，并促进了IL-6和TNF-α的释放，表明GALNT3的缺失加剧了炎症反应和M1极化。总体而言，结果证明GALNT3抑制了OGD/R诱导的小胶质细胞的炎症反应和M1极化。
GALNT3促进TREM2蛋白的O-GalNAc糖基化
GALNT3影响CIRI的途径尚不清楚。众所周知，GALNT3作为粘蛋白型O-糖基化起始酶，可以启动O-GalNAc糖基化修饰，从而影响下游蛋白质的稳定性。本研究首先检测了小胶质细胞中O-GalNAc糖基化修饰的发生。GALNT3过表达诱导了OGD/R处理细胞中Tn抗原（VVL）的表达，表明全局O-GalNAc糖基化增加。在此基础上，对BioGRID数据库的分析揭示了26种可能与GALNT3相互作用的蛋白质。在这些因子中，骨髓细胞触发受体2（TREM2）引起了研究人员的注意。TREM2是一种主要在小胶质细胞中表达的免疫受体，通过抑制小胶质细胞M1极化来缓解CIRI进展。因此，研究假设GALNT3可能通过促进TREM2糖基化修饰和蛋白质稳定性来缓解CIRI进展。为了确认GALNT3和TREM2之间的物理相互作用，将GALNT3-HA和TREM2-Flag质粒共转染到HMC-3细胞中，并使用抗FLAG抗体进行免疫共沉淀。结果显示，GALNT3与TREM2被有效共沉淀。进一步使用针对内源性TREM2的抗体进行Co-IP，以在更生理的条件下验证这种相互作用。与之前一致，GALNT3也被抗TREM2抗体沉淀，证实了GALNT3-TREM2相互作用的特异性和稳健性。由于VVL可以高亲和力结合未修饰的O-GalNAc残基，进一步通过VVL下拉实验评估了GALNT3是否影响TREM2的O-GalNAc糖基化。结果显示，GALNT3促进了TREM2的O-GalNAc糖基化修饰。随后，通过Co-IP结合VVL印迹发现，GALNT3介导的TREM2 O-GalNAc糖基化在一定程度上促进了TREM2蛋白的稳定性。进一步通过NetOGlyc数据库预测发现TREM2中存在3个O-GalNAc糖基化位点，因此构建了每个候选O-糖基化位点（S147A、S158A和S160A）被替换的Flag标签构建体，然后将这些构建体以及Flag标签的TREM2WT质粒转染到HMC-3细胞中，并通过免疫沉淀结合VVL印迹检测TREM2的O-糖基化位点。结果显示，在转染Flag-TREM2(S147A)的细胞中，VVL表达下调最为显著，表明S147可能是TREM2的O-糖基化位点。用蛋白质合成抑制剂放线菌酮（CHX）处理后，进一步检测了不同时间点TREM2蛋白的稳定性。研究发现，GALNT3的过表达促进了TREM2蛋白的稳定性，但在转染Flag-TREM2(S147A)的细胞中，TREM2蛋白的半衰期缩短，这表明GALNT3介导的TREM2在S147位点的O-糖基化促进了TREM2的蛋白质稳定性。总之，这些数据表明，GALNT3在特定位点的O-糖基化对于TREM2蛋白的稳定可能很重要。
GALNT3通过上调TREM2蛋白表达介导小胶质细胞M1极化
最后，验证了TREM2对GALNT3作用的贡献。首先验证了TREM2在HMC-3细胞中的敲低效率；与对照慢病毒相比，感染靶向TREM2的慢病毒显著降低了TREM2的mRNA和蛋白水平。接下来，将GALNT3过表达慢病毒和/或TREM2敲低慢病毒共感染HMC-3细胞，并在OGD/R处理后检测细胞中TREM2和iNOS的表达。GALNT3过表达伴随着TREM2表达的增加，这也导致iNOS表达的下调，但这种趋势被shTREM2逆转。此外，敲低TREM2部分恢复了由GALNT3过表达引起的M1型小胶质细胞标记物CD16/32的表达。进一步评估了IL-6和TNF-α表达的变化。GALNT3过表达显著上调了IL-6和TNF-α的表达，但TREM2敲低抑制了这些因子的表达。总之，这些发现表明GALNT3通过介导TREM2表达参与CIRI进程。
GALNT3/TREM2轴的下游信号机制与上游调控思考
研究进一步探讨了GALNT3/TREM2轴发挥抗炎作用的下游信号机制。现有文献表明，TREM2通过抑制PI3K/NF-κB通路来抑制小胶质细胞炎症，而GALNT3同样被证明可通过阻断TNFR1/NF-κB信号来减轻血管炎症。与这些报告一致，本研究的实验数据揭示，GALNT3过表达在体内显著抑制了tMCAO/R诱导的NF-κB p65磷酸化。此外，在OGD/R处理的小胶质细胞中，GALNT3对p65活化的抑制作用在TREM2敲低后被消除。这些发现共同表明，NF-κB信号通路可能是GALNT3/TREM2轴在CIRI期间调节小胶质细胞极化和炎症反应的关键下游效应器。
除了阐明GALNT3的下游效应，本研究也提出了一个问题：为何GALNT3的表达在缺血条件下受到抑制？基于CIRI的病理过程，推测其下调可能与氧化应激介导的转录抑制有关。CIRI的发生通常伴有氧化应激和过量的ROS生成。氧化应激已被证明会降低关键转录因子（如AP-1）的DNA结合活性，并下调c-Fos和c-Jun蛋白的表达。鉴于这些转录因子已知调节参与糖基化和炎症反应的基因，可以合理推测CIRI期间的氧化应激通过类似机制抑制GALNT3的转录。未来研究缺血应激下GALNT3的转录调控将有助于验证这一假设，并进一步阐明该通路的上游事件。
结论与展望
本研究的结果共同证明，GALNT3通过增强TREM2（主要在丝氨酸147位点）的O-GalNAc糖基化和蛋白质稳定性，对脑缺血-再灌注损伤发挥显著的神经保护作用。这种GALNT3介导的翻译后修饰抑制了小胶质细胞M1极化，减少了促炎细胞因子的释放，并减轻了氧化应激和神经元凋亡。所鉴定的GALNT3/TREM2调节轴为缺血性卒中后神经炎症的调控提供了新的机制见解，并突出了以GALNT3为靶点的O-糖基化作为减轻再灌注相关脑损伤的一种有前景的治疗策略。
未来的研究将系统性地探讨GALNT3及其下游信号在更长的再灌注期内的时序表达模式，这将有助于阐明GALNT3对神经炎症、小胶质细胞极化和神经功能恢复是发挥短暂还是持续的作用，从而更好地界定其作为时间敏感性治疗靶点的潜力。同时，积极推动该通路的临床转化研究，评估调节GALNT3/TREM2轴在相关患者群体中的治疗潜力，将是下一步工作的重点。
