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推荐：本综述通过三维电子显微镜（3D EM）成像、基因编码荧光钙指示剂和电生理记录相结合，深入探讨了第五层（L5）锥体神经元轴突起始段（Axon Initial Segment, AIS）线粒体的分布、活性依赖性钙摄取及其在动作电位（AP）调控中的作用。研究发现，尽管AIS近端密集的线粒体集群能有效缓冲胞质Ca2+并缩短高频刺激后的慢后超极化（slow AHP），但抑制线粒体钙单向转运体（MCU）并不影响AP的输入-输出功能、波形或高频簇状放电能力。这揭示了AIS线粒体强大的钙缓冲能力可能主要参与非电生理功能，为理解神经元亚区室钙稳态的特定作用提供了新视角。
引言
线粒体是真核细胞中负责产生细胞能量载体三磷酸腺苷（ATP）的细胞器。新的研究揭示了线粒体在脂质合成、细胞死亡调控以及钙（Ca2+）稳态方面的额外多功能性。在神经元中，线粒体的这种多功能性尤为显著，神经元高度依赖于ATP和Ca2+稳态来确保动作电位的可靠传播和突触囊泡释放。神经元的强形态极化和区室化结构也反映在线粒体群的多样性上。线粒体钙（mt-Ca2+）缓冲是神经元调节其亚区室内胞质Ca2+水平的有效手段，从而实现对Ca2+依赖性通路的精确时空控制。
一个高度特化的神经元亚区室是轴突起始段（AIS），这是通过高密度电压依赖性离子通道聚集来启动动作电位的部位。虽然AIS轴膜的兴奋性主要由电压依赖性Na+和K+通道主导，但AP的生成也受到电压依赖性Ca2+内流和胞质Ca2+浓度的影响。Ca2+不仅是膜电荷载体，也是一种下游信号分子：轴突的钙激活K+（KCa）通道调节AP衰减时间并降低神经元兴奋性。几种电压门控离子通道具有Ca2+-钙调蛋白感应域，介导Ca2+依赖性电压门控钠通道动力学调节或Kv7通道的关闭。Ca2+依赖性离子通道的调节要求神经元在AIS处精确控制其胞质Ca2+水平，这部分可以通过内部隔离和通过储存调节其释放来实现。
AIS中存在线粒体的报道，但其在该区域的功能仍知之甚少。Ca2+进入线粒体基质的主要途径是通过线粒体钙单向转运体（MCU），这是一种位于线粒体内膜的选择性Ca2+通道。本研究的假设是AIS处的线粒体钙缓冲调节AP的启动和生成。
材料与方法
研究遵循了荷兰皇家艺术与科学学院动物伦理委员会和动物实验中央委员会的批准。使用的实验动物是B6.FVB(Cg)-Tg(Rbp4-cre)KL100Gsat/Mmucd小鼠（简称Rbp4-Cre小鼠），该品系在第五层锥体神经元中选择性表达Cre重组酶。通过立体定位注射携带线粒体靶向绿色荧光蛋白（mt-GFP）或线粒体靶向钙指示剂mt-GCaMP6f的腺相关病毒（AAV）载体，特异性地标记L5锥体神经元的线粒体。制备急性脑切片并进行全细胞膜片钳记录，同时使用双光子显微镜对线粒体和胞质Ca2+进行同步成像。电生理记录溶液在实验组中添加了MCU孔复合体抑制剂Ru360。此外，还利用公开可用的成年小鼠初级视皮层注释三维电子显微镜（3D EM）数据集，分析了L5锥体神经元AIS中线粒体的超微结构分布。
结果
1. 线粒体密集分布于AIS近端
利用3D EM数据对L5锥体神经元AIS（不包括代表轴丘的最初3 μm）和第一个有髓鞘结间段的线粒体进行分段和量化。结果显示，线粒体主要占据AIS的近端，并在远端10 μm处显著减少。在有髓鞘结间段内，线粒体倾向于避免最初约2 μm的结旁区，但其他区域分布均匀。约75%的第一个郎飞结（第一个结间段之后的分支点）含有线粒体。总体而言，AIS的线粒体密度显著高于第一个结间段。将AIS总长度分为前半部分（近端AIS）和后半部分（远端AIS）进行量化，数据显示线粒体在近端AIS明显更丰富，密度超过远端AIS的两倍。此外，远端AIS的线粒体显著小于结间段的线粒体。通过病毒工具在急性脑切片中进行免疫荧光标记和共聚焦显微镜观察，结果与3D EM数据一致，证实线粒体在AIS近端密度最高，并随着与胞体距离的增加而减少。活体双光子成像记录显示，尽管存在一些运动线粒体，但大多数线粒体在AIS处稳定存在。运动线粒体主要以前进方向移动，并且显著小于稳定线粒体。总之，来自EM、免疫组化和活体成像的结果表明，线粒体主要定位于AIS近端并且保持稳定。
2. AIS线粒体缓冲Ca2+
AIS和郎飞结以强大的活性依赖性Ca2+流为特征。通过在L5锥体神经元中表达基因编码的、靶向线粒体的钙指示剂mt-GCaMP6f，并在全细胞记录时用红色钙指示剂染料Cal-590填充胞质，可以同时成像胞质（cyt-Ca2+）和线粒体（mt-Ca2+）中的活性依赖性Ca2+反应。数据显示，在尖峰序列期间，mt-Ca2+瞬变在时间上跟随胞质中的变化。与之前报告一致，mt-Ca2+增加显著延迟约150毫秒，而衰减时间常数相似。比较轴突亚区室的cyt-Ca2+和mt-Ca2+反应幅度显示，两者在AIS中最强，而在有髓鞘结间段中非常微弱甚至不存在。在郎飞结中检测到AP依赖性的cyt-Ca2+增加，但这些与mt-Ca2+瞬变的配对不规则，表明Ca2+内流可能不足以激活MCU。鉴于线粒体大小的差异，研究发现较小的线粒体表现出较大的Ca2+瞬变。总之，这些发现表明，在L5锥体神经元轴突中，AIS处的线粒体强烈缓冲尖峰活性依赖性的胞质Ca2+。
3. mt-Ca2+缓冲缩短慢AHP持续时间
mt-Ca2+缓冲先前已被证明可以减弱cyt-Ca2+浓度并缩短慢AHP的持续时间。由于L5锥体神经元AIS处的cyt-Ca2+达到高浓度，同时影响单个AP特性和慢AHP，因此假设L5锥体神经元中的mt-Ca2+缓冲影响膜兴奋性。为验证此假设，在进行全细胞膜片钳记录的同时，灌注选择性MCU抑制剂Ru360，该抑制剂通过结合线粒体膜间隙的MCU来有效阻断线粒体Ca2+摄取。观察到Ru360灌注45分钟使mt-Ca2+平均减少了81%。接下来，通过多种刺激模式（包括30个APs，20 Hz；200个APs，20 Hz；200个APs，50 Hz；100个APs，100 Hz）检测阻断mt-Ca2+对膜兴奋性的作用，并量化慢AHP的峰值幅度、半高宽和曲线下面积。与先前工作一致，发现Ru360显著增加了AHP的持续时间，但未影响其峰值或曲线下面积，且这种效应仅在高频率下（50或100 Hz）选择性出现。2秒后AHP的幅度在两组之间未检测到处理效应。此外，较慢的膜电流未受影响，膜电位以可比较的速率恢复到基线。静息膜电位也未受Ru360影响。
4. AP特性不依赖于mt-Ca2+缓冲
鉴于L5锥体神经元的慢AHP部分受到mt-Ca2+缓冲的调节，推测这可能也适用于胞体和AIS的其他钙感应电压门控通道，从而影响放电特性。缓慢激活的Kv7通道在远端AIS高密度表达，它设定神经元静息膜特性，调节AP阈值，并由胞质Ca2+门控。随着Ru360介导的mt-Ca2+缓冲丧失，假定的胞质Ca2+增加预计会导致Kv7通道关闭，从而通过降低AP生成的电流阈值来增加神经元兴奋性。为探究这种可能性，注入递增电流阶跃，并比较对照组和Ru360处理组细胞的AP生成。由于mt-Ca2+缓冲发生相对较慢，延迟约150毫秒并在AP放电期间约1秒达到峰值，因此Ru360处理可能优先影响序列末端的AP。然而，未发现Ru360对AP电压阈值、幅度或半高宽有影响。也未检测到电流注入时产生的AP数量、基电流或输入电阻的差异。
L5锥体神经元的特点在于能够产生短时高频簇状放电，这主要由Na+通道的快速开放以及Kv7和BK通道共同塑造，所有这些通道都是钙门控的。推测膜兴奋性的mt-Ca2+调节可能发生在短峰间间隔的时间尺度上，因此在量化平均频率时其贡献可能被掩盖。首先，在建立全细胞通路后立即比较基电流时的高频AP数量，与Ru360或对照灌注45分钟后的数量。在对照组和Ru360灌注的神经元中，都观察到高频AP数量的减少，这可能是由于胞质被细胞内记录溶液冲洗所致。然而，两种处理之间的减少没有差异。同样，维持簇状放电的神经元比例在两组之间相似。其次，在稳定的簇状放电神经元中，比较了簇内AP的特性。簇状放电频率的量化显示，抑制mt-Ca2+缓冲后没有差异。虽然Ru360灌注增加了簇内第一个AP的幅度，但第二个AP的幅度未受影响。此外，所有AP的电压阈值、半高宽和dV/dt值在组间具有可比性。最后，为了研究mt-Ca2+缓冲是否影响AP的AIS成分，记录了单个AP的上冲程。Ru360灌注后，AP幅度、半高宽以及电流和电压阈值保持不变。此外，相位平面图清楚地显示了体细胞记录的AP波形中AIS和胞体成分的电压-时间分离。结果显示，Ru360没有改变AIS或胞体成分的上升速率峰值。与AIS兴奋性不受影响一致，AP起始的快速性在Ru360灌注后未改变。总之，这些电生理学实验表明，AIS处强大的mt-Ca2+缓冲不影响AP的生成。
讨论
结合细胞类型特异的超微结构数据和基因编码的Ca2+成像工具，研究发现新皮质L5锥体神经元AIS处的线粒体密集分布于AIS近端区域，并能强力摄取Ca2+。AP生成在AIS区室产生一些最大的胞质Ca2+上升，这也与显著且区室化的mt-Ca2+摄取相关。此外，与先前研究一致，数据显示在高放电频率下，mt-Ca2+内流缩短了慢AHP初始成分的持续时间。出乎意料的是，尽管使用选择性MCU抑制剂Ru360显著增加了慢AHP，但神经元mt-Ca2+在AP启动或适应中并未发挥作用。AIS处的胞质Ca2+水平调节AP复极化和宽度以及峰间间隔，但对体细胞记录的AP（反映了AIS和胞体树突的兴奋性）分析未发现一致的证据表明AP的动力学和阈值特性在MCU阻断后发生改变。这对于单个AP以及序列中的最终AP都是正确的，后者在时间上与显著的mt-Ca2+摄取重合。此外，AP的AIS成分（在相位平面图中间接可见）未显示Ru360介导的mt-Ca2+阻断的任何效应。
Ru360对AP启动缺乏影响可能与峰生成和兴奋性区室化的时空特征有关。L5锥体神经元的慢AHP被认为可调节峰频率适应，是由钙依赖性K+通道亚型KCa3.1介导的外向K+电流，在高频尖峰序列后持续数十秒。然而，KCa3.1的表达仅限于胞体树突区域，并且在轴突处进行Ca2+解笼并未产生这些缓慢的外向电流，这表明慢AHP是由胞体树突膜产生的，并且更可能由胞体内的线粒体塑造。此外，mt-Ca2+对AIS质膜附近游离Ca2+的贡献可能太慢，或者被其他Ca2+缓冲机制所掩盖。特别是在初级体感皮层的厚顶树突L5锥体神经元中，AIS包含巨大的囊状细胞器，这是一种由平滑内质网（ER）组成的大型特化囊状细胞器变体，它通过钙诱导的钙释放决定了约50%的AP依赖性Ca2+上升。尽管遗传消融囊状细胞器不影响AP放电率，但ER Ca2+处理可能与线粒体相互作用以塑造AIS处的胞质Ca2+。
钙激活的BK通道在毫秒内产生快速AHP，由质膜附近的Ca2+域激活，并具有亚毫秒的激活动力学。相比之下，发现AIS mt-Ca2+缓冲以约150毫秒的时间延迟跟随cyt-Ca2+瞬变，这与之前的报告非常一致。这种延迟在时间上与钙门控的Kv7通道重叠，Kv7通道在静息时部分开放，需要数十毫秒才能完全激活并调节峰频率适应。然而，无论是稳态AP放电还是基电流都未受影响，这表明Kv7通道可能未被mt-Ca2+摄取修饰。一个有趣的未来研究替代实验方法是结合膜片钳记录和光学方法，以局部破坏AIS mt-Ca2+缓冲。总之，基于目前的电生理学分析，数据表明mt-Ca2+隔离缓冲在L5锥体神经元的基线AP特性中不起作用。AP启动和峰适应独立于MCU相关的Ca2+摄取的发现，与MCU敲除小鼠在基线条件下通常保留的认知和运动控制一致。
AIS线粒体的解剖分布和非电生理作用
AIS远端线粒体数量相对于结间段较少，这很好地支持了最近在哺乳动物运动神经元、人诱导多能干细胞和果蝇AIS中线粒体分布的新见解。这里，通过识别线粒体的近端-远端梯度，扩展了这些观察结果，在AIS远端区域线粒体明显更小。决定线粒体沿AIS亚域分布的分子机制尚不清楚。线粒体的钙依赖性锚定部分由衔接蛋白Miro或锚定蛋白syntaphilin介导。然而，由于Ca2+内流沿AIS均匀较高，并且线粒体聚集在无Ca2+内流的情况下也会发生，因此该机制不太可能解释这种梯度。另一种可能性是线粒体与内质网（例如通过囊泡相关膜蛋白相关蛋白）或轴突膜结合。就目前所知，线粒体并未物理束缚于电压门控离子通道，但考虑到它们沿近端-远端轴的空间非均匀分布，有趣的是推测定义亚域定位的机制可能是（部分）共享的，或者离子通道的分布引导了线粒体的聚集。
由于AP启动通常出现在AIS远端区域，解剖和功能数据表明，在基线条件下，线粒体钙处理对于AP启动是非必需的。如果兴奋性不受影响，那么线粒体在AIS中的作用可能是什么？一个有趣的可能性是，AIS处的MCU介导的Ca2+导入可能在胞质Ca2+升高的长时间内参与，并作为细胞稳态和结构可塑性的指导信号，类似于其在树突棘和突触前末梢的作用。与此观点一致，全局MCU敲除保留了基线活动水平和线粒体超微结构，但使皮层神经元在呼吸能力无法抵消增加的糖酵解需求时变得脆弱。在神经元活动强烈增加期间，远端AIS通过从远端AIS质膜内吞电压门控Na+通道和锚蛋白G蛋白在数十分钟内缩短。由神经元活动或短暂N-甲基-D-天冬氨酸受体激活诱导的AIS可塑性是一个Ca2+依赖性过程。更极端的AIS可塑性诱导方案表明，AIS分解需要蛋白酶体。线粒体很可能在重塑过程中停靠在AIS细胞骨架的位点上。一个有趣的实验是在AIS可塑性期间对皮层L2/3细胞（在正常条件下显示结构AIS可塑性，与其L5对应物不同）进行基因沉默MCU并成像mt-GFP。
AIS处的线粒体可能在维持轴突完整性方面发挥重要作用，并在脱髓鞘和/或神经退行性疾病等病理条件下变得至关重要。支持这一观点的是，在线粒体在AIS内数量和大小增加，并在损伤模型和肌萎缩侧索硬化中积聚在远端AIS。在脱髓鞘轴突中，线粒体锚定蛋白syntaphilin是线粒体固定、聚集和大小增加所必需的。病理条件下的AIS线粒体可能支持神经元兴奋性的适应或指导轴突货物运输。例如，肌萎缩侧索硬化中的运动神经元在线粒体在AIS积聚，其特征是AIS长度缩短和兴奋性降低。神经损伤通常诱导蛋白酶体介导的AIS分解，随后线粒体运输到远端轴突以支持损伤修复。有趣的是，这一过程在肌萎缩侧索硬化小鼠模型中被破坏。先前已有描述AIS处的线粒体控制TAU蛋白的运输，这表明其他轴突货物的运输也可能受AIS线粒体调节。AIS完整性、线粒体和轴突损伤之间复杂且双向的相互作用仍有待进一步研究。在海马神经元中药物增强mt-Ca2+缓冲可挽救癫痫症状，其中AIS处的mt-Ca2+缓冲可能参与其中。总之，当前研究结果表明，L5锥体神经元在微区水平调节其轴突线粒体含量，线粒体聚集在AIS近端，但对于维持正常水平的膜兴奋性是非必需的。这些数据为探索线粒体在可塑性和病理过程中AIS的（分解）组装和维护中的作用开辟了途径。
