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本刊隆重推荐这项革新性研究。作者团队成功开发了一套包含12台高速相机的全景电压敏感光学标测系统，结合创新的足球形成像腔室与三维多视角协同运动追踪算法，首次实现了对孤立完整兔心整个心室表面在强收缩状态下动作电位波的高分辨率、全景三维成像。该系统突破了传统光学标测技术必须药物抑制心脏收缩的长期限制，能够同时、原位测量电激动、动作电位时程与机械应变，为在健康与疾病状态下，以前所未有的分辨率研究心脏电-机械生理学与耦联机制，提供了强大工具。
文章内容归纳
摘要
心跳是由电脉冲触发收缩运动的复杂动态过程。电压敏感荧光成像（光学标测）是研究心脏电生理和心律失常的重要工具。然而，由于心脏运动会产生严重的运动伪影，传统的光学标测必须在药物抑制收缩的心脏上进行，这限制了对心脏电生理与组织力学耦联的研究。本研究引入了一种多相机光学标测系统，利用12台高速相机、比率式电压敏感成像和三维多视角运动追踪，首次成功重建了完整、强收缩的孤立兔心整个心室表面的三维形变，并同步进行了电压敏感测量。该系统在窦性心律、起搏心律和心室颤动期间，均能以前所未有的高空间（电学：0.5-1.0百万像素，120 μm/像素；力学：~0.5-3.0 mm/三角形）和时间（2 ms）分辨率进行成像。例如，本研究测量了窦性心律期间钾离子通道药理阻断引起的动作电位时程和收缩变化，观察了起搏期间紧随电激动前沿的机械应变波，并在心室颤动期间观察到了电-机械涡流。该成像系统确立了该领域新的技术标杆，可用于以前所未有的分辨率研究健康和疾病状态下的心脏电-机械生理学。
引言
心跳是一个涉及生物电和生物力学现象的高度动态过程。理解这些复杂动力学对于理解各种心脏病及开发更好的诊疗方法至关重要。尽管正常心跳通过浦肯野系统几乎同时发生快速去极化，但异常节律可由多种电激动模式触发，例如室性早搏期间的局灶性模式，或心房/心室颤动期间的旋转性或折返性模式。电激动异常可导致收缩异常，反之亦然。例如，心肌梗死不仅与心肌组织僵硬和收缩力降低有关，还可能改变电通路并诱发心律失常。此外，机械拉伸可通过机械敏感离子通道影响动作电位，进而影响机械收缩。
多年来，在整个心脏中成像这些动态过程一直是个挑战。光学技术是完成此任务的理想高分辨率模态。然而，在跳动的心脏中高分辨率测量动作电位波一直是心血管研究中长期存在的技术挑战。诸如多电极阵列或基于导管的电极标测等电学标测技术是可行的选择，但存在空间分辨率低、测量细胞外电位而非动作电位、需要与组织物理接触以及通常不允许同时测量组织应变等局限。更近期，使用柔性纳米线电极阵列或可拉伸贴片变得可以同时测量电脉冲现象和机械拉伸，但这些技术仅从非常有限的位置提供测量数据，且不直接测量心脏动作电位。最后，使用电压敏感荧光成像或光学标测可以在离体心脏表面无接触、高空间分辨率地测量动作电位波。但主要挑战在于心脏表面产生的光学信号非常微小，且由于其对运动的敏感性，光学标测常规在药物收缩抑制的心脏上进行。使用多相机系统对运动抑制心脏的整个心脏表面进行电压敏感光学标测已有先例，但对收缩心脏表面进行动作电位波的光学标测则更具挑战性，相关研究很少，而使用多相机光学标测重建三维形变心脏表面的研究则更少。
在本研究中，我们首次展示了在完整、强收缩的离体心脏整个心室表面上完全全景的动作电位波测量。三维测量数据是使用包含12台高速相机的多相机光学标测系统获得的。测量得益于近期低成本相机的可用性、定制设计的球形成像腔室、用于比率式成像的脉冲照明以及三维多视角运动追踪算法。凭借球形足球形成像腔室，可以用多达48个发光二极管和多达24台相机从所有侧面均匀地照明和成像心脏。使用12台相机，我们在窦性心律、起搏节律和心室颤动期间，对动作电位波在离体完整兔心整个收缩的心室表面的传播进行了成像。我们以高时空分辨率标测了动作电位波并测量了心外膜变形和组织应变，首次观察到电-机械波，其由电激动前沿和紧随电激动在整个心脏传播的应变波组成。我们的成像系统不仅是第一个覆盖心脏整个360°心室表面的完全全景电-机械光学标测系统，而且提供了前所未有的空间分辨率，并比先前报道的三维电-机械光学标测系统有几项关键改进和实际优势。
技术背景
光学标测是一种高度灵敏的测量技术，用于量化染料或基因指示剂响应生理变化（如心脏动作电位期间跨膜电位的变化）所表现出的微小荧光分数变化。心脏光学标测研究中的运动通常与所谓的运动伪影相关联。在正常心脏运动且无数值运动校正的情况下，运动伪影会完全破坏测量。数值运动跟踪可以有效地规避运动伪影，特别是当进一步与比率式成像结合时。然而，消除运动伪影并在收缩的心脏表面上测量无伪影的动作电位仍然是一个尚未解决的非平凡挑战。
数值运动跟踪和三维物体重建是计算机视觉领域的常规任务。然而，尽管在工程和其他领域广泛应用，计算机视觉技术仍未在心脏光学标测研究中得到充分利用。另一方面，收缩心脏的三维光学标测是比大多数其他计算机视觉任务更具挑战性的问题。技术挑战包括：需要精确跟踪组织，有时需要亚像素精度，以便能够测量没有运动伪影的光学信号；光学信号小，即使轻微的跟踪错误也可能导致大的测量误差；荧光随时间快速变化，反映生理功能，这可能会干扰跟踪算法并引入跟踪伪影；噪声、不均匀照明和其他因素可能导致进一步的跟踪和测量伪影。总体而言，视频数据包含由荧光指示剂、滤光片和低分辨率相机决定的非常特殊的图像特征。因此，迄今为止，只有少数研究报道了重建和光学标测跳动心脏三维表面的尝试。
方法
伦理批准、心脏分离程序与Langendorff灌注
所有程序均符合美国法律下的动物福利法，并获得加州大学旧金山分校机构动物护理和使用委员会的批准。研究仅涉及组织收集，未对活体动物进行任何操作。健康的新西兰白兔被深度麻醉，心脏在开胸手术中快速切除，并立即转移到冰停搏液中。心脏在冰停搏液中准备后，在20-45分钟内转移到成像装置中，进行恒压逆行Langendorff灌注。心脏被放置在一个充满温暖、氧合台氏液的成像腔室内，并通过水套储液器、加热盘管等进行灌注，维持灌注压力和温度恒定。
足球形成像腔室
我们设计了一个球形足球形成像腔室，便于用多达24台相机同时对收缩心脏进行全景光学标测。该腔室基于截角二十面体（足球）几何形状，顶部开放，有24个五边形或六边形表面，底部有 outflow。可通过24个表面中的每个表面的圆形窗口进行成像。相邻两个窗口之间的光轴角度约为31.7°或37.4°。可通过位于五边形/六边形表面之间的顶点处的48个小圆窗（LED端口）提供照明。腔室的大小由相机和镜头的工作距离、心脏大小以及进行成像的窗口大小决定。心脏被定位在成像腔室的中心，可以通过所有窗口无障碍地成像，并同样可以被所有LED无障碍地照明。腔室通过3D打印（材料：白色PLA+）制造。
多相机光学标测
多相机光学标测使用12台高速互补金属氧化物半导体相机进行，这些相机围绕成像腔室放置在光学平台上。相机通过万向臂对齐和固定。相邻相机之间的平均角度约为40±10°。使用12台相机，可以在相机视场之间实现足够大的重叠，并且至少有三台相机同时观察表面上的一点，实现密集覆盖。相机以500帧/秒的速度成像，空间分辨率为440×320像素。通过信号发生器和自定义软件触发相机以同步视频采集。发射光通过安装在各相机上的机器视觉镜头和发射滤光片收集。视频通过计算机的USB端口流式传输。
比率式电压敏感光学标测
心脏用电压敏感荧光染料Di-4-ANEPPS染色。光学标测在连续模式（连续绿光激发）或比率式模式（脉冲绿蓝光激发）下进行。使用多达48个高功率、多色RGBW LED从所有侧面照明心室。LED安装在成像窗口之间的端口中，并指向成像腔室中心。在连续绿光模式下，我们只持续为绿色二极管供电。在比率式模式下，我们使用两个电源交替为蓝色和绿色二极管供电，通过定制的LED驱动器在蓝绿两组之间快速切换电源。LED驱动器的触发与相机采集同步，使得奇数和偶数视频帧分别被蓝光或绿光照明2毫秒。相应地，蓝色和绿色视频的有效采集速度为250帧/秒。在连续模式下，我们使用红色长通发射滤光片。在比率式或脉冲模式下，我们使用橙红色带通滤光片，以在绿光照明下产生负的荧光分数变化ΔF/F，在蓝光照明下不产生分数变化。在此配置下，蓝光通道可用于测量心脏表面在非均匀照明场景中移动时的照明变化。
节律控制、相机校准、三维运动跟踪与表面重建
使用定制微电极和隔离脉冲刺激器诱导起搏节律。通过快速起搏诱导心室颤动，并使用定制除颤器终止。动作电位延长通过切换到含有氯化钡的低钾台氏液引起。使用multical和ChArUco校准靶进行相机校准，以确定相机的外在和内在参数，并建立相机之间的相对位置和方向对齐。利用相机校准，我们使用COLMAP为随时间推移的每一帧生成心脏的原始静态三维重建。随后，使用由Klaudiny和Hilton描述的三维网格跟踪技术，从静态重建的各个网格中计算出一个单一的、代表运动心脏表面动态重建的移动网格。该合作性基于补丁的网格跟踪技术通过跟踪模板网格的顶点，从静态重建的各个网格中产生一个具有固定拓扑结构和随时间顶点数相同的单一移动网格。在连续或单通道模式下，我们使用从第一个原始网格创建的模板网格进行逐帧跟踪。在比率式或脉冲模式下，我们从蓝光通道的第一个原始网格创建一个模板网格，然后使用该网格分别在蓝光和绿光通道中进行逐帧跟踪。
后处理、动作电位时程测量、相位图与相位奇点计算
移动网格的顶点描述了心脏表面的运动。利用该信息，可以在共移动参考系中进行信号分析。我们将视频图像使用三维网格在相机图像中的二维投影运动进行扭曲，以便能够在基于图像的共移动参考系中进一步处理数据。由于网格的分辨率低于视频图像的分辨率，我们进一步在已扭曲的视频图像上执行基于二维光流的运动跟踪，并相对于参考视频图像进一步扭曲它们。所有后处理均在共移动参考系中，并使用optimap在单个扭曲视频图像中以基于图像的方式进行。随后，我们将后处理的逐像素归一化光学图在重扭曲回静态实验室坐标系后，纹理映射到三维心脏表面上。为计算动作电位时程和APD图，我们从每个三角形的中心提取原始比率式光学轨迹，并使用自定义的去趋势和基线去除算法进一步后处理轨迹。动作电位上升支通过检测每个光学轨迹时间导数的峰值来计算。随后，计算第一和第二时间导数的平滑版本，并计算第一导数的负峰和第二导数的正峰，分别作为复极相和复极结束的估计值。相位图使用optimap从运动稳定和逐像素归一化的光学标测视频中在每个相机单独计算。使用希尔伯特变换计算每个时间序列的相位角。得到的相位图使用复数阶参数滤波器进行平滑。平滑后的二维相位图随后被投影到三维网格上，并在相应像素重叠时从多个相机视角取平均。通过在网格表面计算相位的梯度环积分来计算相位奇点。
结果
窦性心律
我们使用收缩的离体兔心进行了完全全景的电压敏感光学标测，在窦性心律期间对整个三维收缩的心室表面进行了动作电位波成像。数据显示，我们可以跟踪窦性心律期间整个强变形的三维心室表面。随后，我们可以用非比率式和比率式成像，标测在整個強變形的三维心室表面上传播的动作电位波前沿和动作电位波。特别是，通过比率式成像，我们可以测量动作电位的时程及其APD。三维跟踪使我们能够补偿运动伪影，并在共移动参考系中测量心脏表面的光学轨迹。我们可以计算显示每个像素（在每个三角形上）时空电活动的光学图，并将电活动与心脏的机械收缩相关联。数据显示，心室在去极化开始后约30毫秒才开始明显收缩，并在去极化开始后40-50毫秒左右达到约0.1 m s?1的最大收缩速度。去极化相和收缩开始时间明显分开。通过低钾氯化钡台氏液，动作电位延长（APD增加），收缩缩短。我们观察到在正常和低钾氯化钡台氏液下分别存在正的和负的电-机械窗口。负电-机械窗口与动作电位在心肌松弛之前复极化有关。我们的数据表明，我们可以以高时空分辨率同时测量心跳的电学和机械动力学。
起搏节律期间的电-机械波
为了研究电激动与机械变形之间的关系，我们对从刺激部位传播出去、穿过心室的局灶性动作电位波进行了成像。起搏脉冲通过放置在心室心外膜表面的柔性刺激电极施加。利用我们的多视角重建方法，我们能够跟踪电极下的组织，因为它始终至少在其他两到三台相机图像中可见。数据显示，心室电激动与运动之间有很强的相关性。局灶性动作电位波导致心室以一种非常特征性的方式变形：当肌肉在起搏位置附近收缩时，更远处的组织被拉向心脏的收缩部分。随后，被拉动的组织经历扩张或拉伸应变。此外，随着电波前沿在心室的扩散，收缩紧随电波。绘制心外膜应变率，我们看到电波前沿立即被一个机械波前沿所跟随，该波前沿被定义为从扩张（蓝色）到收缩（红色）应变率的转变。这个机械激动前沿跟随电激动前沿，在前后心室壁传播时有约5.0±2.4 ms的短延迟。基于此观察，我们计算了机械激动时间作为从正（扩张）到负（收缩）应变率的转变，随后计算了机械激动图，该图与相应的电激动图表现出相似性。电波前沿和机械波前沿沿后壁的传播速度具有可比性。重要的是，虽然电和机械激动时间在心室大部分区域相关性良好，但并非所有地方都如此，特别是在起搏电极附近。
心室颤动
心室颤动期间，心脏仅发生最小程度的收缩。然而，心室颤动期间的残余收缩运动仍足以产生显著的运动伪影。本研究讨论了两段心室颤动发作：一段运动非常小（VF1），一段有中度收缩运动（VF2）。VF1发作表明，即使运动非常小，也必须在光学标测研究中跟踪和补偿运动，否则运动伪影会变得非常强，以至于阻碍数据的进一步分析。数据显示，通过运动稳定和共移动信号分析计算的光学图没有表现出任何显著的运动伪影，而是显示了多个折返性涡旋状动作电位波模式。在VF1中，APD极短，约为30-40 ms，波长约为1-3 mm。组织平均仅移动约0.2-0.3 mm。从运动稳定的轨迹计算相位图，强调动作电位波模式的涡旋状结构和拓扑组织，并指示电涡波旋转中心为相位奇点。在VF2发作中，由于较大的收缩，可以观察到折返性动作电位涡波在心外膜心室表面诱导出涡旋状三维变形模式。数据显示，在心室颤动期间，动作电位波与组织变形之间有很强的相关性，并暗示心脏壁收缩和变形动力学中的拓扑缺陷与电相位奇点共定位。
