《CNS Neuroscience & Therapeutics》：IL-17A Promotes NETs Formation via the PKCζ–ERK–ROS–PAD4 Pathway in a Mouse Model of Ischemic Stroke
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本文通过构建小鼠脑缺血再灌注模型，结合体内外实验，首次揭示白细胞介素-17A（IL-17A）通过激活蛋白激酶Cζ（PKCζ）-细胞外信号调节激酶（ERK）-活性氧（ROS）-肽酰基精氨酸脱亚氨酶4（PAD4）信号通路，上调PAD4表达，从而促进中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）形成，加重缺血性脑损伤的分子机制。研究提示，靶向该通路（IL-17A、PAD4等）是治疗脑卒中的潜在新策略。
引言：探究脑卒中后神经损伤加剧的新机制
脑卒中是全球范围内导致高发病率、死亡率及残疾的主要原因之一。当前，急性缺血性脑卒中的主要治疗手段是血管再通，但其再通率有限。因此，探索新的神经保护靶点至关重要。近年来，中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）——一种由DNA骨架及组蛋白、髓过氧化物酶（MPO）、中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）等构成的网状结构——在缺血性脑卒中患者血栓中被发现，并与不良神经预后密切相关。NETs不仅参与血栓形成，也介入卒中后的脑组织炎症反应。
在NETs的形成过程中，肽酰基精氨酸脱亚氨酶4（PAD4）起着关键作用。PAD4可介导组蛋白H3瓜氨酸化（CitH3），导致染色质去浓缩、核膜破裂，最终形成NETs。然而，缺血性脑卒中中调控PAD4激活的上游机制尚不明确。
白细胞介素-17A（IL-17A）是IL-17家族的关键细胞因子，在宿主防御和组织炎症中发挥核心作用。研究表明，IL-17A可加剧小鼠脑缺血损伤，并可能调节NETs形成，但其精确的分子机制仍未阐明。本研究旨在探讨IL-17A如何在缺血性脑卒中后调节NETs生成，以期为卒中治疗提供新的策略。
方法与模型：多维度验证信号通路
本研究主要采用小鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型模拟缺血性脑卒中。通过腹腔注射PAD4特异性抑制剂GSK484，或脑室注射IL-17A中和性抗体（IL-17mAb）进行干预。同时，使用IL-17A基因敲除（IL-17A-/-）小鼠及从外周血分离的原代中性粒细胞，在体外进一步验证信号通路。
神经功能评估综合运用了旋转杆实验、平衡木测试、Rodriguez神经功能评分及Longa评分等多种方法。分子水平上，通过蛋白质免疫印迹（Western Blot）和免疫荧光染色检测了PAD4、MPO、CitH3、PKCζ、磷酸化细胞外信号调节激酶（p-ERK）等蛋白的表达。并利用DCFH-DA探针法检测中性粒细胞内活性氧（ROS）水平。
结果发现：抑制PAD4与靶向IL-17A均能有效减轻脑损伤
首先，研究人员证实了抑制PAD4的有效性。在MCAO小鼠模型中，腹腔注射GSK484可显著缩小脑梗死体积，并改善小鼠在旋转杆、平衡木等多项测试中的神经功能表现。Western Blot和免疫荧光结果显示，MCAO后脑组织中PAD4、MPO和CitH3蛋白水平显著升高，而GSK484处理能有效降低这些蛋白的表达，表明其通过抑制PAD4来减少NETs形成。
接着，研究聚焦于上游调控因子IL-17A。在MCAO模型中，脑室注射IL-17A中和性抗体（IL-17mAb）同样能降低梗死周边区域PAD4、MPO和CitH3的表达。此外，IL-17A敲除（IL-17A-/-）小鼠在接受MCAO手术后，其梗死周边区域的PAD4和CitH3表达也显著低于野生型对照小鼠。这些体内实验一致表明，IL-17A是缺血后PAD4激活和NETs形成的关键上游调节因子。
进一步的机制探索发现，MCAO后，PKCζ和p-ERK的蛋白表达水平也显著上调，而IL-17mAb治疗可抑制它们的表达，提示IL-17A可能通过PKCζ/ERK通路调控PAD4。
机制阐明：IL-17A-PKCζ-ERK-ROS-PAD4信号轴的级联与反馈
为在细胞水平验证上述通路，研究团队分离了小鼠原代中性粒细胞，并用重组小鼠IL-17A（rmIL-17A）进行刺激。结果表明，IL-17A刺激可上调中性粒细胞内PKCζ、p-ERK、ROS及PAD4的水平。
通过使用通路特异性抑制剂进行干预，研究人员逐步阐明了信号传递的层级关系：使用PKCζ抑制剂（ζ-Stat）预处理，可减弱IL-17A诱导的p-ERK、ROS和PAD4上调；使用ERK抑制剂（Ravoxertinib）预处理，可减弱ROS和PAD4的上调，并对PKCζ表达有部分降低作用；使用ROS抑制剂（Apocynin）预处理，可选择性地降低PAD4表达，同时部分降低PKCζ和ERK的表达；而使用PAD4抑制剂（GSK484）预处理，则对上游的PKCζ和ERK表达无反馈影响。
这些结果证明，IL-17A通过“PKCζ–ERK–ROS–PAD4”这一信号级联通路上调PAD4，从而促进NETs形成。值得注意的是，该通路并非简单的线性级联，而是一个存在多节点正反馈交叉对话的网络。例如，活化的ERK可通过磷酸化稳定PKCζ；ROS可通过对半胱氨酸残基的氧化修饰增强PKCζ活性，并通过抑制MKP-1等负调节因子来稳定ERK磷酸化。此外，PAD4介导的NETs形成会释放CitH3和MPO，后者可激活NADPH氧化酶复合物促进ROS产生，形成又一个正反馈回路。这些反馈环路在生理上放大了缺血期间的炎症信号，确保了NETs的有效形成，从而参与病理过程。
讨论与展望：为卒中治疗提供新的潜在靶点
本研究揭示了一条先前未知的“IL-17A–PKCζ–ERK–ROS–PAD4”信号通路，它促进了NETs的形成并恶化了卒中结局。这一发现具有重要的临床意义。首先，直接使用PAD4抑制剂GSK484可显著减轻脑损伤并促进功能恢复。其次，IL-17A通过该新发现的分子通路影响NETs形成。最后，靶向IL-17A（无论是基因敲除还是药物中和）能产生与直接抑制PAD4相似的保护效果。这些发现提示，针对该通路上的多个节点——IL-17A、PKCζ、ERK、ROS或PAD4——进行干预，以阻断有害的NETs形成，可能成为改善卒中预后的新治疗策略。
尽管重组组织型纤溶酶原激活剂（rt-PA）和机械取栓仍是急性缺血性脑卒中的主要再通治疗方法，但其疗效部分受到NETs介导的血栓抵抗性的限制。本研究结果表明，通过靶向IL-17A或PAD4及其信号通路来抑制NETs形成，可能有效增强溶栓疗效并减轻脑组织炎症损伤。
当然，本研究也存在一些局限性，例如主要使用了MCAO小鼠模型和体外实验，未在其他卒中模型中进行验证；NETs的形成是复杂的过程，除PAD4外可能还有其他机制参与。未来的研究可拓展至其他卒中模型，并在不同条件下验证PAD4和IL-17A的作用，优化药物剂量和给药时机，以更好地指导临床应用。
结论
总而言之，本研究证实了IL-17A通过PKCζ–ERK–ROS信号轴调控PAD4及NETs形成，为缺血性脑卒中的治疗提供了新的潜在靶点。这一发现为开发针对IL-17A和PAD4的联合治疗策略奠定了有希望的基础。
