《Journal of Hazardous Materials》：Virtual effect-directed analysis of granulated rubber identifies bioactive chemicals and distinct hazard profiles
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本研究针对人造草坪橡胶填充颗粒中潜在有毒化学物质识别难题，研究人员应用虚拟效应导向分析（vEDA）方法，整合效应分析和化学筛选，揭示了不同橡胶材料中存在的AhR、ERα和p53等生物活性化合物，并确认甲基化屈及其异构体和IPPD分别是驱动芳香烃受体（AhR）活性和p53通路激活的关键贡献者，为评估和优先管理橡胶材料的化学危害提供了有力的早期预警工具。
橡胶，这种在现代社会中无处不在的材料，在2022年产量高达约2960万吨，广泛应用于各类产品。然而，橡胶制品在使用寿命末期，常被粉碎后重新利用，例如作为人造草坪和游乐场的地面填充物。这就带来了一个令人担忧的问题：在橡胶生产和加工过程中添加的大量化学物质，以及高温硫化等工艺可能产生的非有意添加物质，会从这些橡胶颗粒中释放到环境中。尤其考虑到儿童是经常接触游乐场和运动场的高敏感人群，对橡胶中化学物质的潜在危害进行评估显得尤为重要。尽管有研究指出，提取的橡胶化学品比塑料相关化学品具有更高的急性毒性，但对橡胶材料，特别是不同类型橡胶填充物进行全面、深入的化学和毒理学表征仍然不足。先前研究曾发现苯乙烯-丁二烯橡胶（SBR）填充物显示出高水平的芳香烃受体（AhR）和雌激素受体α（ERα）活性，但其中绝大部分生物活性无法用已知的化学物质解释，这突显了对橡胶进行全面化学表征以识别驱动这些生物活性的关键化合物的迫切需求。
为了更高效、更系统地应对这一挑战，瑞典厄勒布鲁大学的Fredric S?dergren Seilitz、Maria Larsson等研究人员在《Journal of Hazardous Materials》上发表了一项研究。他们没有采用传统上耗时且通量有限、需要反复分级和生物测试的效应导向分析（EDA），而是应用了一种创新的虚拟效应导向分析（vEDA）工作流程。这种方法将基于生物报告基因检测的毒理学评估与化学分析（包括目标分析和基于高分辨质谱的疑似物筛选）相结合，通过统计学分析而非物理分级来关联化学组分与生物效应数据，从而能够快速地从复杂混合物中优先识别出潜在的有害化合物。
本研究采用了几个关键技术方法。研究团队从斯德哥尔摩市化学中心获取了21种主要用于人造草坪和游乐场的材料样本，包括SBR、热塑性聚烯烃（TPO）、三元乙丙橡胶（EPDM）、软木聚氨酯树脂、聚乙烯（PE）和矿物涂层材料，形成了一个有代表性的样本队列。在分析层面，核心是整合了效应检测与化学分析。首先，利用一系列基于细胞的生物报告基因检测法（CALUX? assays）评估了样本提取物对五个关键毒理学终点的活性，包括AhR、ERα、p53通路的激活以及甲状腺激素受体β（TRβ）和雄激素受体（AR）的拮抗活性。其次，在化学分析上，进行了目标定量分析，测定了87种多环芳烃化合物（PAC-87），并利用气相色谱-高分辨质谱（GC-HRMS）进行非目标/疑似物筛选，初步鉴定了大量化学组分。最后，通过vEDA工作流程，将疑似鉴定的化学物质与公共数据库（如PubChem、ToxCast）和预测模型（如aiQSAR、admetSAR）中的生物活性数据关联，并结合单变量统计分析（比较高活性与低活性样本组间的化学信号差异），优先筛选出可能与观察到的生物活性相关的候选化合物，进而对其进行毒理学确认和定量贡献评估。
3.1. 橡胶提取物中的生物活性
研究人员发现，除一个聚乙烯样本外，所有样本均显示出AhR激动活性。其中，SBR样本的活性最高，苯并[a]芘当量（BEQ）范围在1190至31,400 ng/g之间。四个样本（三个SBR和一个红色EPDM）诱导了可测量的p53通路激活，表明存在潜在的遗传毒性化合物。两个EPDM样本显示出ERα激动活性。而所有样本均未表现出AR或TRβ拮抗活性。这些结果为后续的vEDA分析提供了效应差异的基础。
3.2. 已知AhR激动剂的贡献
对87种目标PAC的定量分析显示，SBR样本中PAC总浓度最高。然而，利用已有的相对效能因子计算发现，已知的AhR激动性PAC只能部分解释观察到的AhR活性，在活性最高的SBR样本中解释率仅约26%，在TPO-5和EPDM-1中甚至低于1%。这表明有很大一部分活性来源于其他未知或未被充分认识的化合物，例如样本中浓度相对较高的甲基化屈异构体。
3.3. 潜在生物活性化合物的识别
通过GC-HRMS疑似物筛选，研究人员共初步鉴定了281个组分。利用数据库和模型对这些组分进行生物活性注释后，发现了29个潜在AhR激动剂、32个潜在ERα激动剂和18个潜在p53激动剂。通过比较高活性样本与低活性样本中化学信号的差异（log2-fold change），并结合生物活性注释，最终优先筛选出25个化合物（主要为AhR和p53候选激动剂）进行后续确认。
3.4. 优先生物活性化合物的确认和贡献
在获得参考标准品并进行验证后，研究对优先化合物进行了毒理学测试和定量分析。关键发现包括：
- 1.
p53活性驱动者：在测试的化合物中，N-异丙基-N'-苯基-对苯二胺（IPPD）被证实具有p53激动活性，并在p53活性最高的SBR-2样本中解释了约50%的观察到的活性。
- 2.
AhR活性主要贡献者：在测试的20个潜在AhR激动剂中，有18个在PAH CALUX检测中显示出活性。其中，苯胺类添加剂（1-PANA, 2-PANA, DPPD）虽然浓度很高，但效力很低，对总AhR活性的贡献不足1%。相反，甲基化屈异构体（如2-甲基屈、3-甲基屈）显示出相对较高的AhR激动效力，是观察到的AhR活性的主要贡献者，在某些样本中贡献率高达65%。其他被测试的PAC贡献则相对较小。
- 3.
vEDA工作流程的效果：通过vEDA工作流程识别和确认的新化合物，显著提高了对观察到的生物活性的解释程度。例如，在SBR-1样本中，AhR活性的解释率从~26%提高到了~53%；在SBR-4样本中，从~23%提高到了98%。
结论与重要意义
本研究通过成功应用vEDA工作流程，系统地表征了不同类型橡胶及替代填充材料的化学与毒理学特征，并得出了若干重要结论。首先，研究证实了整合效应数据与化学筛查对于优先识别复杂混合物中的生物活性物质具有重要价值。其次，研究揭示了不同材料间明显的危害特征差异：替代填充材料（TPO、软木、矿物）表现出比传统SBR和EPDM更低的生物活性、PAC及橡胶添加剂含量；SBR具有最高的遗传毒性潜力、AhR活性和PAC浓度；而EPDM是唯一显示ERα活性的聚合物。从风险管理的角度看，IPPD和甲基化屈异构体（以及潜在的二甲基化屈异构体和7-甲基苯并[a]芘）是需要特别关注的化合物。
这项研究的核心意义在于方法学和应用层面。在方法学上，它展示了vEDA作为一种高效的早期预警工具，能够在无需繁琐物理分级的情况下，从大量化学数据中快速定位潜在有害物质，尤其适用于样本集异质性高、传统多变量分析受限的情况。在应用层面，研究结果为评估和比较不同橡胶填充材料的化学安全性提供了直接证据，支持了用危害特征更优的替代材料逐步替换某些传统材料（如SBR）的决策。同时，研究所识别的关键活性化合物（如IPPD、甲基化屈），为后续的环境监测、人体暴露评估以及相关法规标准的制定提供了明确的目标和科学依据。总之，该研究强调了将基于效应的方法与化学表征相结合，对于识别再生和再利用橡胶材料中的新兴化学风险、指导替代策略和监管决策具有重要价值。
