编辑推荐：
MOF-nanozyme基于人工过氧化物酶开发，实现谷胱甘肽高灵敏检测（LOD 0.002 mg/L），pH 4.0-7.0稳定，15次循环性能良好，选择性抑制干扰物质。血清检测验证其在心血管疾病诊断中的应用价值。
作者：Masoud Dehghanipour, Munthar Kadhim Abosaoda, Ashok Kumar Bishoyi, M.M. Rekha, Mayank Kundlas, V. Kavitha, Subhashree Ray, Kamal Kant
创新纳米与工程MBM实验室，邮政信箱78164-18799，Sirjan，伊朗
摘要
本文介绍了一种由新型MOF纳米酶开发的超灵敏谷胱甘肽纳米酶生物传感器。首先，对这种MOF纳米酶的酶样活性及其化学/生化特性进行了表征。该传感器的工作pH范围为4.0–7.0，循环稳定性至少为15次，热稳定性高（在60°C下为93.7%，持续160分钟），保质期为30天。对其人工过氧化物酶的动力学研究表明，OPD的Km为0.078 mM，Vmax为0.0196 μM·s-1·mg-1；H2O2的Km为2.9 μM，Vmax为0.0113 μM·s-1·mg-1。随后，开发了一种新型的超灵敏、可重复使用的人工酶介导的方法，用于选择性检测谷胱甘肽，同时排除抗坏血酸和半胱氨酸的干扰，该方法在0.005–15 mg·L-1-1
引言
天然酶作为自然界和生物体内多种生物和化学反应的生物催化剂而广为人知，通常由蛋白质骨架组成；然而，研究人员也探索了少数具有RNA骨架的酶[1]。这些具有蛋白质/RNA骨架的生物催化剂由于具有高催化效率和反应特异性，在生物、临床、工业和环境领域展现出巨大潜力[2],[3],[4]。尽管具有上述优势，天然酶生物催化剂仍存在一些严重问题，如环境稳定性低、生产与纯化成本高以及难以回收（大多数天然酶在其原始状态下不可重复使用）。这些缺点限制了它们的实际应用[5],[6]。为克服这些问题并使天然酶生物催化剂能够实际应用，研究人员开发了新型人工酶，即能够模拟酶功能的人工化合物[7],[8],[9],[10],[11],[12]。2007年，Gao教授等人通过研究发现Fe3O4纳米颗粒具有类似天然过氧化物酶的活性，这标志着纳米酶时代的开端[25]。这些新型人工酶对环境变化具有极高的稳定性，并且工作pH/温度范围广泛。与难以回收的天然酶不同，人工酶具有优异的回收性和循环稳定性[26],[27],[28]。在Gao教授首次报道纳米级酶化学物质之后，人们合成了多种具有酶样特性的纳米材料，例如具有过氧化物酶活性的氮掺杂碳量子点[29]、天然Co3O4纳米颗粒[30]、锰改性的Co3O4纳米片[31]、某些类型的金属有机框架（如NEQC-340[32]、MnO2[33],[34]）、碳纳米材料[35]、裸露和功能化的Fe3O4纳米颗粒[36],[37]、Au/N掺杂的碳点纳米酶[38]、磁性金属有机框架[39]、基于Mxene的纳米酶[40]、负载Pd的羟基磷灰石复合材料[41]，以及银纳米颗粒（AgNPs）和金纳米颗粒（AuNPs）[42]、铜纳米颗粒（CuNPs）[42]，这些材料可用于模拟酶的功能。此外，金属纳米簇（尤其是银纳米簇、金纳米簇和铂纳米簇）以及铜纳米簇[43],[44],[45]也被用作模拟多种酶（包括过氧化物酶、氧化酶和过氧化氢酶）功能的活性剂。在各种纳米酶中，MOF纳米酶（包括Cu-MOFs）由于具有出色的稳定性、成本效益和高度可调的结构，相比天然酶和传统催化剂具有显著优势。它们的多孔晶体结构使得金属活性位点可以精确调控，从而提高了在生物传感和治疗性清除活性氧（ROS）等应用中的催化效率。这些纳米酶已被用于催化多种生物和化学反应，应用于化学合成、分析研究和生物分析领域。从更精确的角度来看，纳米级大小分布的人工过氧化物酶能够高效催化TMB、OPD、DAB、DPD和ABTS等常见过氧化物酶底物的氧化反应，生成相应的有色产物。这些有色产物在可见光区域具有显著的吸光度，可通过肉眼或分光光度计检测。在某些抑制剂存在下，颜色会发生变化，纳米酶的活性也会减弱。这种颜色变化通常与抑制剂浓度呈线性关系，因此这些纳米酶及其反应特性被用于检测不同实际样品中的抑制剂[46]。已有许多生物/化学传感器被开发用于定量检测过氧化氢[37],[47]、胺类[34]、生物标志物[48]、半胱氨酸[49]、谷胱甘肽[50]、金属离子[51]等。除了分析应用外，人工过氧化物酶还被广泛用作可重复使用且高度稳定的生物催化剂，用于染料降解、化学催化和食品分析[52],[53]。
L-γ-谷氨酰-L-半胱氨酰甘氨酸（即谷胱甘肽GSH）通过抑制过氧化物和自由基（包括羟基自由基、超氧阴离子等）等活性氧物质，保护细胞成分免受损伤[54]。研究表明，L-γ-谷氨酰-L-半胱氨酰甘氨酸在体内对抗内源性损伤、外源性损伤和多种疾病中起着关键作用。其异常水平与某些疾病相关，检测生物流体中的谷胱甘肽水平可作为诊断这些疾病的可靠生物标志物，例如在临床实验室中用于心血管疾病的诊断[55]。鉴于谷胱甘肽检测在生物样本中的重要性，已开发出多种方法（包括电化学方法[56]、质谱法[57]、分光光度法[58]和高效液相色谱法[59]）来检测谷胱甘肽。然而，这些方法分析耗时较长且需要昂贵的仪器。基于分光光度法的比色法因具有肉眼可见的信号、低成本、简单的检测流程和良好的灵敏度而受到关注[55]。尽管如此，现有的谷胱甘肽传感器对类似物质（尤其是半胱氨酸和抗坏血酸）的选择性较低。因此，开发一种对谷胱甘肽具有高选择性的新型化学/生物传感器对于实现可靠、准确的谷胱甘肽检测至关重要[32]。为解决这些问题，本文合成并表征了一种新型、高稳定性且可重复使用的纳米多孔MOF纳米酶。验证了该纳米酶的酶样活性后，对其pH稳定性、热稳定性、保质期和循环稳定性进行了生化表征，并将其动力学性能与天然酶进行了比较。随后，开发了一种超灵敏的分光光度法人工酶介导的生物传感器，用于在实验室测试中选择性可靠地检测谷胱甘肽，以辅助心血管疾病的诊断。优化了传感性能的关键参数，并计算了该生物传感器的优势指标。最终，该纳米多孔酶被用于健康人群和心血管疾病患者的血清样本中检测谷胱甘肽，获得了准确的结果。
材料与仪器
实验所需的材料包括磷酸、H2O2、半胱氨酸、谷胱甘肽、硼酸、Cu(CH3COO)2、Cr(NO3)2、谷氨酸、苯丙氨酸、乙酸、抗坏血酸、亮氨酸、异亮氨酸、磷酸钠、FeCl3.6H2O、ZnBr2、丙氨酸、NaOH、谷氨酰胺、o-苯二胺（OPD）、p-苯二胺、NaCl、柠檬酸、KCl、组氨酸和苏氨酸，均由Merck公司提供。去离子水由Zolal Teb Shimico（伊朗）公司提供。记录数据使用了Nicolet公司的Magna 550 FT-IR光谱仪。
MOF纳米酶的表征
使用多种仪器方法对制备的材料进行了表征，同时评估了其水解稳定性和配位能力，并证实了其酶样活性。
结论
本文介绍了一种由新型MOF纳米酶开发的超灵敏谷胱甘肽纳米酶生物传感器。该纳米酶的工作pH范围为4.0–7.0，循环稳定性至少为15次，热稳定性高（在60°C下为93.7%，持续160分钟），保质期为30天。对其人工过氧化物酶的动力学研究表明，Km为0.078 mM，Vmax为0.0196 μM。
缩写说明
所有缩写在首次使用时已在文中定义，为便于读者理解，相关内容列于表3中。
CRediT作者贡献声明
Masoud Dehghanipour：负责撰写初稿、验证和方法学设计。
Munthar Kadhim Abosaoda：负责撰写初稿、数据可视化和方法学设计。
Ashok Kumar Bishoyi：负责撰写初稿、验证和方法学设计。
M.M. Rekha：负责撰写初稿、验证和方法学设计。
Mayank Kundlas：负责撰写初稿、验证和方法学设计。
V. Kavitha：负责撰写初稿、数据可视化和方法学设计。
Subhashree Ray：负责撰写初稿、验证和方法学设计。
Kamal Kant：
